光緒詔定國是後，光緒為首的帝黨和慈禧為首的後黨的矛盾逐漸加深。在這尖銳的帝、後黨衝突中，楊深秀自覺地站在維新派一邊，以非常堅決的態度，同守舊派展開了針鋒相對的鬥爭。
當時，公然反對變法且氣焰比較囂張的是禮部尚書許應6.此人連守舊派元老李慈銘都認為他“素以不學為名，語言甚鄙。”楊深秀更認為他“品行平常，見識庸謬，妄自尊大，剛愎淩人。”可他“庸妄狂悖，腹誹朝旨”，專門和維新事業作對：光緒“為鼓舞人才起見，特開經濟特科”，他就“在禮部堂上倡言經濟特科之無益”；光緒“日患經濟之才少，而思所以養之”，他則“日患經濟之才多，而思所以遏之。”對待維新派他刻骨仇恨，“遇有通達時務之士，則疾之如仇。”但在帝國主義麵前，他又卑躬屈節，畏之如虎。在和德使海靖爭論時，“德使？目一視，以手視察，尚未發言，而許應6已失色，即趨出總署，德使乃大笑，加以訕誚，此等之事不一而足。”就是這種守舊之徒，卻擔任著禮部尚書及總理各國事務大臣等重要職務。為了鏟除這個障礙，楊深秀和禦史宋伯魯專為彈劾許應6而上奏光緒。在奏折中，他詳細列舉了許應6“窒塞風氣，禁抑人才”，阻撓新政劣跡，並明確指出，這類人留在總署必然“傷邦交而損國體”。所以必須將其“解去部職”，“退出總理衙門行走”，這樣“內可以去新政之壅蔽，外可以免鄰邦之笑柄”，還可以為“守舊誤國者戒”。這個奏折受到光緒的重視，不久就將許應6及其同黨革職，多少起到“懲一警百”的作用，對維新派是很大的鼓舞，梁啟超十分讚賞楊深秀這種“不畏強禦”的舉動，將他譽為“開新誌士之眉目”。
1898年9月，維新派與守舊派的鬥爭空前激烈。守舊派為廢黜光緒進行了周密的布置，京津一帶風聲鶴唳。光緒雖知道慈禧天津閱兵的陰謀，一氣之下裁去了一批頑固派官僚，以示反抗，但終因不掌握軍政實權而沒有徹底扭轉局勢。麵臨危境，楊深秀仍上奏光緒，彈劾守舊派。如：“粵撫許振球老耄貪庸……自奉到詔書，未嚐舉行一事”；“河道總督任道溶，貪狹素著”；“湖北巡撫譚繼洵守舊迂拘”；“王秉恩久在廣，貪險奸橫，無所不至……把持各局，大類權奸”；“歐陽霖久辦厘金，刻薄成性，怨聲載道”；楊樞“招搖納賄，把握威福”；陳寶琛“居鄉貪鄙，網盡商賈之利，行同市儈”等等。對這些“聲名狼藉之輩”，“即不逢裁缺，亦當分別罷斥，或優之聽其告休。”他特別強調在處理他們時要堅決徹底，“既被裁即請任其歸去，勿汲汲別議擢用，庶免阻撓新政。”
楊深秀在批判、彈劾守舊派的同時，還直接參與和支持維新派的活動。
如前所述，楊深秀和康有為交往較多，康有為對他特別看重。“初入京與相見，即褒獎不置，稱為西北一人。”楊深秀確也沒有辜負康有為的信任。當康有為立會保國時，本來曾同意和康有為一起“伏闕痛哭力求變法”的“台諫中知名之人”，絕大多數“皆不與聞”，楊深秀則“兩次到會，列名傳布”，並親自到文悌官邸向他宣傳康有為“立會保國”的主張，還把自己組織的關學會並入保國會，置於康有為的領導之下。而這正是榮祿宣布“如有相識入會者，令其小心首領”的時候。當康有為受到慈禧集團責難時，他又和宋伯魯“同以百口保康有為”。在慈禧訓政後，他還不顧自己的安危，“上疏詰問有為罪名”，以示抗議。湖南巡撫陳寶箴是積極推行新政的官吏，“銳意整頓，為中華自強之嚆矢”，卻受到守舊派的竭力反對，“其誣詞不可聽聞”，楊深秀就“抗疏為寶箴辯”。
楊深秀認為，對維新派在保薦人才時薦舉的一些守舊者，也應該罷斥，同時也要處罰保薦這些守舊者的維新派官吏，以利推行新政。例如在陳寶箴所保薦的人員中，除楊銳、劉光第、左孝同諸人以外，其餘多是“守舊中之猾吏”，這是由陳寶箴“無真識定力”所造成的。因此他建議光緒對陳寶箴也要“嚴旨儆勉，以作其氣”，而對於他所“保舉之人”，則應該“分別加以黜陟，萬勿一概重用”。他提醒光緒，即使對陳寶箴這樣的“新政重臣”所推薦的人，也應加以分析，而不能“信其所得皆賢，盡加拔擢。”這是因為“舉行新政，綜核名實之日，舉一人須得一人之用。”很明顯，楊深秀要求“嚴旨懲勉”陳寶箴和守舊派對陳寶箴的“交章彈劾”有本質的不同。區別就在於楊深秀是通過“儆？勉”敦促陳寶箴糾過，而守舊派彈劾陳寶箴則是為了鏟除推行新政的骨幹力量。這就看出楊深秀對維新變法的忠實程度――既為推行新政的人搖旗呐喊，反擊守舊派對他們的攻擊，又不容忍他們身上存在的不利於變法的妥協行為。
楊深秀對清統治者能否真正推行他的主張並沒抱很大希望，他認為“本朝氣數已一息奄奄待盡，尚能誅諫官乎！”所以他曾設想，如果出現像唐朝起兵反對武則天腐朽統治的徐敬業那樣的勇士，他決心做積極協助徐敬業起兵的駱賓王那樣的人――“八旗宗室中如有徐敬業其人，我則為駱丞矣。”說明他已初步產生了起兵反清的思想。
百日維新期間，台諫中有兩個極為活躍的人物，一是被稱為戊戌六君子的楊深秀，另一個是當時執掌山東道監察禦史宋伯魯。伯魯思想敏銳，學通中外，在擔任禦史的數年中，“豐裁峻整，彈劾不避權貴”，尤其是在變法開始後，他發人之所不敢發，言人之所不敢言，與阻撓維新的頑固派進行了反複較量，對百日維新起了促進作用。親曆戊戌變法的梁啟超就曾指出，台諫諸臣中，惟宋伯魯“言諸新政最多”。