正文 第六章 家蠶杆狀病毒Bm67基因功能(1 / 2)

第一節Bm67基因序列及分析

一、Bm67基因閱讀框分析

Bm67(orf67)基因位於BmNPV基因組61188~61892 nt之間,計算機軟件分析結果表明,該閱讀框全長705bp,編碼234個氨基酸,預計分子量為27 kDa,等電點為9.20。在Bm67基因起始密碼子ATG上遊57bp處存在一個典型的杆狀病毒晚期啟動子結構ATAAG。在終止密碼子TGA下遊8bp處含有一個典型的真核生物mRNA轉錄終止poly(A)加尾信號AATAAA。

二、Bm67蛋白二級結構分析

采用InterproScan和SOSUI軟件對Bm67蛋白進行的結構分析表明,該蛋白沒有發現明顯的信號肽特征以及跨膜結構域跨膜結構域。搜索P

rosite數據庫發現,該蛋白有4個蛋白激酶C的磷酸化位點(5~7 aa、16~18 aa、28~30 aa和228~230 aa),3個cAMP 和 cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(17~20 aa 、29~32 aa和169~172 aa),2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(22~25 aa和32~35 aa)和1個N端糖基化位點(44~47 aa)。

三、Bm67蛋白同源性比較

采用Blastp搜索引擎在EMBL/GenBank/PIR等數據庫中尋找同源序列,結果表明,Bm67是一個保守性很強的蛋白,在所有已測序的杆狀病毒基因組裏都能找到同源基因。這些蛋白的同源性介於92%和22%之間,與AcMNPV的ORF81蛋白同源性達到92%,與雙翅目昆蟲杆狀病毒庫蚊(CuniNPV)ORF106的同源性最低。

Bm67屬於杆狀病毒功能未知的基因。對Bm67的核苷酸序列分析,發現Bm67是一個非常保守的杆狀病毒核心基因,並且存在一個晚期轉錄基序ATAAG。該基序在杆狀病毒的多數晚期基因中都得到了證實,例如病毒晚期發生的病毒蛋白基因pk1、sod和pif等。所以,從核苷酸分析表明Bm67很可能是一個晚期基因,從而推測可能與病毒的感染晚期有關。

第二節 杆狀病毒Bm67基因的轉錄與表達

一、Bm67的轉錄時相

為了確定Bm67在病毒感染的BmN細胞中的轉錄情況,從感染了BmNPV不同時間的BmN細胞中提取總RNA,進行RT PCR。結果如圖563所示。從感染病毒後18小時開始,樣品中出現了分子量約為719bp的條帶,該轉錄本持續到感染後72小時仍可檢測到。

二、Bm67的表達時相

已經確定了Bm67蛋白的多克隆抗體在BmNPV感染72小時後的 BmN細胞中有1條27kDa的雜交帶,與推測的蛋白大小一致。為了進一步確定蛋白在感染細胞中的表達情況,收取了BmNPV感染的BmN 0~96小時的細胞樣品,用Bm67多克隆抗體進行Western blot分析,確定了該蛋白在病毒感染細胞中的表達時相。結果發現在感染後24~72小時的細胞中均有一條大小為27 kDa的特異蛋白質帶能與Bm67抗體發生特異性反應,表明該蛋白從24小時開始可以檢測到,是一個晚期表達的蛋白。