第一節 基因芯片原理
一、基因芯片基本原理
基因芯片這一技術方法在1991年的Science雜誌上被首次提出，其高通量、並行檢測的特點適應了分析人類基因組計劃所提供的海量的基因序列信息的需要。可以說，人類基因組計劃是基因芯片技術發展的原因，而對深入研究基因突變和基因表達的有效方法的需求又是促進基因芯片技術發展的動力。由於基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點，其誕生以來就受到科學界的廣泛關注，正如晶體管電路向集成電路發展的經曆一樣，分子生物學技術的集成化正在使生命科學的研究和應用發生一場革命。根據固定在芯片載體上的核酸分子的不同，基因芯片可以分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片等。寡核苷酸芯片主要基於光引導聚合技術，該技術是Affymetrix公司開發的專利技術，由於其突出的優點，正得到越來越廣泛的應用。
基因芯片（gene chip,DNA chip），又稱DNA微陣列（DNA micorarray）基因芯片（gene chip,DNA chip），又稱DNA微陣列（DNA micorarray），是指按照預定位置固定在固相載體上很小麵積內的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。
二、cDNA芯片基本方法
基因芯片技術主要包括4個主要步驟：芯片製備、樣品製備、雜交反應和信號檢測及結果分析。樣品製備包括分離和標記2個方麵，有些樣品還應經過核酸擴增放大這一步驟。樣品製備的一般過程是：提取待檢樣品中的mRNA，反轉錄成cDNA，同時標記上熒光。熒光標記為最常用的方法。優點是無放射性且有多種顏色可供使用；研究者可以根據需要選用其他標記方法，例如同位素標記法、化學發光法或酶標法。如果目的是研究2種來源的組織細胞基因的差異表達，則分別提取2種組織細胞的mRNA，反轉錄成cDNA，分別標記2種不同顏色的熒光（如Cy3和Cy5），等量混合後與芯片進行雜交反應。
三、cDNA 用KLENOW 酶標記
取反轉錄產物，以Random Primer 為引物進行KLENOW 酶標記，標記產物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit （MN）純化，純化後抽幹。標記過程中dNTP、dATP、dGTP和dTTP使用濃度為120 mol/L，dCTP使用濃度為60 mol/L，Cys5dCTP和Cy3dCTP使用濃度為40 mol/L。Cy5dCTP 、Cy3dCTP（GE Healthcare Cat. No. PA 55021/ PA 53021）。
第二節 家蠶抗BmNPV基因芯片分析
一、高密度家蠶Oligo芯片Oligo芯片雜交結果
在芯片實驗中，為了減少實驗帶來的係統誤差和個體差異，實驗重複了2次。Cy5標記的BC8和Cy3標記的306的cDNA和芯片上的探針陣列進行競爭性雜交。在激光共聚焦掃描的圖像上，如果某一基因在BC8中的表達高於306，則芯片上該點上結合的Cy5的量多於Cy3，在掃描結果中顯示為紅色；反之則顯示為綠色；如果大致相等則顯示為黃色。2次雜交結果經數據收集整理後，進行實驗的重複性驗證，結果如彩圖631所示，發現2次芯片掃描的偽色圖的一致性非常高。
二、芯片的圖像處理及數據采集結果
掃描圖像應用GenePix pro 4.0圖像分析軟件進行分析，把圖像信號轉換為數字信號，然後對數據用非線性方法進行標準化處理，得到2組芯片數據，這樣芯片上的每一個基因都會得到熒光交換前後的2個表達比值（ratio），隻有在2次雜交實驗中變化趨勢相同的基因才被認為是真正有差異表達的基因。本部分研究共得到2組表達數據（數據未列出），將2組基因表達數據以散點圖的方法顯示。散點圖是一個芯片數據的二維圖表結構，X軸和Y軸分別代表306和BC8信號強度值，以到對角線的距離表示ratio值。基因表達高的點比基因表達低的點位於離原點更遠的距離；而受誘導或抑製的基因則分別位於對角線上方或下方。圖中每一個數據點代表芯片上1個基因點的雜交信號，紅色標記和綠色標記的數據點分別表示Y/X的ratio值≥2和≤0.5，可能是屬於表達有差異的基因，黑色標記表示Y/X的ratio值在0.5~2之間，表達基本無差異。