正文 第六章 家蠶遺傳模型篩選抗核型多角體病毒相關蛋白(2 / 2)

抗性品係特異性蛋白參與的pathway列於橫坐標軸上方,感性品係特異性蛋白參與的pathway列於橫坐標軸下方。蛋白的pathway屬於4種類型:氨基酸代謝;有機物代謝;聚糖合成及代謝;其他氨基酸代謝。縱坐標表示pathway的個數。

第六節 差異蛋白的Western blot驗證

因為半胱天冬酶1和絲氨酸蛋白酶都隻在抗性品係中表達,不在感性品係中表達,並且在正交組和反交組中都如此,所以它們可能在家蠶抗病毒過程中發揮非常重要的作用。正因如此,用Western blot實驗來驗證這2個蛋白在各品係家蠶中的差異表達。半胱天冬酶1的Western blot所用的抗體是兔源抗粉紋夜蛾半胱天冬酶1多克隆抗體(美國Bentley教授熱情提供),絲氨酸蛋白酶的Western blot所用的抗體是兔源抗煙草天蛾絲氨酸蛋白酶多克隆抗體(美國Jiang教授熱情提供)。為了驗證所用的抗體是否能識別家蠶的抗原蛋白,先用得到的抗體來與原核表達的家蠶半胱天冬酶1和絲氨酸蛋白酶進行雜交,看有無目的條帶出現。在對應於原核表達的半胱天冬酶1的位置上,PVDF膜上出現了明顯的條帶,條帶大小與原核表達的家蠶蛋白大小幾乎一致。結果表明Bentley教授提供的抗體能用於本實驗研究。

在對應於原核表達的絲氨酸蛋白酶的位置上,PVDF膜上出現了明顯的條帶,條帶大小與原核表達的家蠶蛋白大小幾乎一致。結果表明Jiang教授提供的抗體能用於本實驗研究。另外,由於沒有內參蛋白的相應抗體,做Western blot時沒有內參。為了解決這一問題,根據所測得的各品係家蠶中腸總蛋白的濃度,每份樣品吸取70 μg的總蛋白PAGE膠,染色後觀察泳道顏色的深淺。結果顯示各個總蛋白樣品對應的泳道顏色深淺大致相同,表明蛋白濃度檢測結果可靠,在做Western blot時隻要理論上樣量相當,實際的上樣量也幾乎相同。在Western blot實驗時,使用70 μg各個品係的蛋白樣品。結果顯示,對於半胱天冬酶1和絲氨酸蛋白酶,在NB♀、D F1、NB♂、R F1品係中,都出現明顯的目的條帶。但是在306♂和306♀品係中,沒有對應的目的條帶出現。結果表明,半胱天冬酶1和絲氨酸蛋白酶隻在抗性品係家蠶中表達,不在感性家蠶中表達,這與二維電泳的實驗結果一致,很好地驗證了二維電泳實驗的結果。

第七節 半胱天冬酶1和絲氨酸蛋白酶與抗BmNPV

近年來的研究表明,當Culex pipiens被西尼羅病毒感染時,在中腸中有誘導細胞凋亡細胞凋亡現象。當Choristoneura fumiferana細胞被虹彩病毒感染時,半胱天冬酶的活性會急劇地上升。半胱天冬酶是一種保守的天冬氨酸特異性蛋白酶,在細胞凋亡中起關鍵作用,並且在病毒感染和抗病毒反應中起作用。細胞凋亡的主要機製在整個動物界從線蟲到果蠅一直到人類中都很保守。許多信號,包括病毒感染都能誘導宿主通過激活起始半胱天冬酶來執行細胞凋亡。在人Hela細胞係中,病毒感染的細胞通過依賴細胞凋亡的吞噬作用可以直接消滅病毒。另外,細胞凋亡可以被一種名為zVADfmk的半胱天冬酶抑製劑所抑製,說明在人體中半胱天冬酶應該在細胞凋亡過程中起作用。在昆蟲中,已經有報道說細胞凋亡是防衛杆狀病毒感染的有效的免疫防治機製。在毛蟲Spodoptera frugiperda體內,細胞凋亡的誘導與杆狀病毒感染力的下降有相關性。以上例子說明在一些物種中,細胞凋亡能夠產生抗病毒的作用。

絲氨酸蛋白酶是一個人們熟知的昆蟲免疫作用參與者,同時它也被證明是一個重要的抗病毒因子。如Nakazawa等報道,絲氨酸蛋白酶2隻在家蠶的中腸表達,如果將它與NPV病毒一起孵育,可以大大地降低病毒的感染能力。這可能是因為絲氨酸蛋白酶可以水解病毒的蛋白,因為有研究表明黑虎蟹(Penaeus monodon)中的絲氨酸蛋白酶類似物可以直接與黃頭病毒接觸。本研究結果顯示絲氨酸蛋白酶在抗性品係中的表達量很高,但在感性品係家蠶中檢測不到表達,表明這種蛋白可能在家蠶抗病毒過程中起到重要作用。

半胱天冬酶1與絲氨酸蛋白酶在正交組、反交組和抗性品係中都特異性地表達,感性品係中未能檢測,但這兩個蛋白僅與抗性有關,是否是關鍵蛋白需要進一步證明。