利用UPLC—Q—TOF—MSE快速分析四物湯中的化學成分
化學
作者：王鎮方 趙陽 龐旭 餘河水 康利平 高月 馬百平
[摘要] 該研究利用UPLC-Q-TOF-MSE技術分析了四物湯的化學成分。通過正、負離子模式的檢測，根據質譜數據以及相關文獻，快速表征了43個色譜峰，鑒定了其中的25個化合物，主要包括來自白芍的8個單萜糖苷類化合物和來自川芎、當歸的13個苯酞類化合物。同時，通過MarkerLynx軟件進行主成分分析和偏最小二乘法分析，比較了四物湯水提液和60%乙醇提取液中的化學成分差異，為探討四物湯補血作用的物質基礎提供了依據。
[關鍵詞] 四物湯；UPLC-Q-TOF-MSE；化學成分；MarkerLynx；提取方法
[收稿日期] 2013-07-18
[基金項目] 國家科技支撐計劃項目（2008BAI51B02）；國家自然科學基金重點項目（）
[通信作者] *馬百平，研究員，Tel：（010），E-mail： mabaiping@sina、com 四物湯起源於宋代《太平惠民和劑局方》，由熟地、當歸、白芍、川芎四味藥材按15∶10∶10∶6配伍組成，具有養血調經、補血活血的功效，用於血虛所致的頭暈眼花，麵色萎黃，心悸氣短及月經不調等[1-3]。
中藥複方是通過多成分、多途徑、多靶點而發揮其治療作用的，其複雜的化學組成與藥效之間的關聯性一直是人們關注的熱點。前期研究發現，四物湯采用60%乙醇提取，再經SP825大孔吸附樹脂富集得到的40%～95%乙醇洗脫部位對於輻射所致小鼠白細胞、血小板降低有較好的抑製作用；但傳統上四物湯多采用的水提方法得到的相同部位卻無相同作用。為了研究四物湯補血作用的物質基礎，本研究通過UPLC-Q-TOF-MSE技術對水提液和60%乙醇提取液的化學成分進行了差異性分析。
近年來，國內有學者對四物湯的化學成分進行了研究，采用的分析手段多為TLC，HPLC，GC-MS等[4-6]。目前，隨著液質聯用技術的發展和成熟，其快速、高效、簡便的特點，在快速分析鑒定中藥化學成分方麵的明顯優勢，使其日漸成為中藥複雜成分的有效分析方法[7-8]。本實驗利用超高效液相色譜和四級杆飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MSE）聯用技術，根據各色譜峰的精確分子質量、碎片離子峰及保留時間，並結合對照品液質信息和相關文獻，快速表征了43個色譜峰，鑒定了其中25個化合物；同時，利用MarkerLynx軟件，比較了四物湯水提取與60%乙醇提取在化學成分上的差異，為四物湯補血作用的物質基礎研究奠定了基礎。
1 材料與方法
1、1 儀器與試劑 Waters ACQUITYTM UPLC 超高效液相色譜係統（Waters Corporation， Milford， MA， USA），Waters SYNAPT MS 質譜係統（Waters Corporation， Manchester， UK）。色譜純乙腈（Fisher，USA），色譜純甲酸（Acros Co、 Ltd、，NJ， USA），超純水為自製，過Millipore 超純水純化係統（Millipore， Billerica， USA），其他試劑均為市售分析純。
四物湯各藥材飲片均購自北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，經天津中醫藥大學張麗娟教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的炮製加工品，傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的幹燥根，川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的幹燥根莖，毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的幹燥根。
芍藥苷（S-010-）、芍藥內酯苷（S-011-），購自北京金寶在線科技有限公司，經HPLC檢測，純度均大於98%；毛蕊花糖苷（-）購自中國食品藥品檢定研究院，經HPLC檢測，純度為94、8%。
1、2 對照品溶液製備分別稱取對照品芍藥苷、芍藥內酯苷、毛蕊花糖苷各約0、3 mg，分別溶解於1 mL甲醇中。各取30 μL，分別稀釋至500 μL，均經0、22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液5 μL進行分析。
1、3 供試品溶液製備取熟地15 g、當歸10 g、白芍10 g、川芎6 g，用8倍量的水回流提取2次，每次1、5 h，趁熱過濾，合並濾液，減壓濃縮後進行SP825大孔吸附樹脂柱色譜分離，水除雜後，收集95%乙醇洗脫部分，得四物湯水提液（SWTS）；另取等量藥材，用8倍量的60%乙醇溶液回流提取2次，後經與水提液相同處理方法處理得四物湯醇提液（SWTC）。分別減壓濃縮，各取2 mL經0、22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液5 μL進樣分析。
1、4 色譜和質譜條件色譜柱為ACQUITY HSS T3 C18（2、1 mm×100 mm， 1、8 μm）。流動相A為0、1% 甲酸水溶液，B為乙腈。洗脫梯度，0～0、5 min，5% B；0、5～8 min，5%～45% B；8～9 min，45%～48% B；9～16 min，48%～50% B；16～18、5 min，50%～60% B；18、5～19 min，60%～75% B ；19～20 min，75%～80% B；20～22 min，80%～85% B；22～23、5 min，85%～95% B。柱溫45 ℃。流速0、5 mL·min-1。
電噴霧電離離子源（ESI），準確質量數用leucine enkephalin作校正液。離子化模式為正、負離子，離子源溫度為100 ℃，除溶劑氣體為氮氣，溫度為450 ℃，流速為 800 L·h-1，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為30 V，掃描範圍m/z 100～1 500。低能量掃描時trap電壓為6 eV，transfer電壓為4 eV，高能量掃描時trap電壓為45～60 eV，transfer電壓為15 eV。
應用MassLynx，MarkerLynx 軟件對質譜數據進行分析。
2 結果
應用UPLC-Q-TOF-MSE技術在上述色譜和質譜條件下對供試品溶液和對照品溶液進行分析，可以得到SWTS和SWTC的正、負基峰離子色譜圖（BPI）1。先通過各色譜峰的正、負準分子離子峰的精確分子質量及相應加合離子峰得到化合物的可能分子式，再根據各色譜峰的碎片離子信號和色譜保留時間，並結合對照品的質譜、色譜行為和四物湯複方及各單味藥的文獻報道，可以推測各主要色譜峰的可能結構式，快速表征了43個色譜峰，鑒定了其中的25個化合物。利用MarkerLynx軟件對傳統水提液與60%乙醇提取液的化學成分進行了比較和差異性分析。
a、負離子模式下SWTC；b、負離子模式下SWTS；c、正離子模式下SWTC；d、正離子模式下SWTS。
UPLC-Q-TOF-MSE分析比較、鑒定SWTS與SWTC中化學成分的基峰離子流圖
Fig、1 The BPI of SWTS and SWTC from UPLC-Q-TOF-MSE analysis for identification and comparison
2、1 化學成分鑒定化合物1，2，8的準分子離子峰均為m/z 479、15[M-H]-，且有相同的加合離子峰m/z 515、13[M+Cl]-，525、16 [M+HCOO]-，可以確定三者分子式均為C23H28O11。在高能量負離子上，化合物1，2，8都顯示m/z 283、08苯甲酰葡萄糖碎片離子峰，121、03苯甲酸碎片離子峰，其中化合物1，2都有脫苯甲酰基碎片離子m/z 375、12 [M-H-104]-，此外，化合物2中還存在m/z 449、143 8 [M-H-CH2O]-，而m/z 345、120 5 [M-H-CH2O-104]-，327、104 9 [M-H-CH2O-122]-，165、055 1[M-H-CH2O-122-162]-，依次為脫苯甲酰基、脫苯甲酸及其脫糖碎片。化合物8顯示463、222 7，203、070 1等碎片，這些碎片可以用來區別化合物1，2，8[9-10]。其中化合物1，2的保留時間及質譜數據分別與對照品芍藥內酯苷、芍藥苷一致，確定1為芍藥內酯苷，2為芍藥苷，8為芍藥苷的同分異構體。化合物3的準分子離子峰為m/z 197、045 0 [M-H]-，表明其分子式為C9H10O5，結合m/z 169、011 6 [M-H-C2H4]-的碎片離子和文獻[11]推測化合物3為沒食子酸乙酯。
芍藥內酯苷、芍藥苷的質譜圖
Fig、2 Mass spectrum of albiflorin and paeoniflorin