免疫熒光標記技術始創於20世紀40年代初。1942年，Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。當時由於異氰酸熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至1958年，Riggs等合成了性能較為優良的異硫氰酸熒光素，Marshall等又對熒光抗體標記的方法進行了改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。
免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗體或抗原標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針，檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和位置，以及利用定量技術（比如流式細胞術）測定含量。
在臨床檢驗上，免疫熒光技術已用作細菌、病毒和寄生蟲等的檢驗及自身免疫病的診斷等。
一、直接免疫熒光法檢測B淋巴細胞
任務簡介
B淋巴細胞膜上攜帶有膜表麵免疫球蛋白，這是B淋巴細胞的表麵標誌。SmIg能與相應抗體結合，如在淋巴細胞懸液中加入熒光素標記的抗全Ig血清，則B細胞膜上的SmIg與熒光抗體結合，用熒光顯微鏡檢測，可檢出所有B淋巴細胞。
凡與熒光抗體結合的細胞，在熒光顯微鏡下，細胞膜呈現熒光，即為SmIg陽性細胞（B淋巴細胞）。如同時用普通光源照明，計數該視野中淋巴細胞總數，便可算出SmIg陽性細胞或帶各類SmIg細胞的百分比。
通過本任務要求熟悉免疫熒光法檢測B淋巴細胞的原理；觀察免疫熒光染色細胞的形態和類型；掌握SmIg陽性細胞在熒光顯微鏡下的形態特征並且學習使用熒光顯微鏡。
所需的材料和設備
1.材料和試劑
熒光標記的兔或羊抗人Ig血清；待檢者肝素抗凝靜脈血；含5％胎牛血清的Hanks液；密度1.077g／mL±0.001g／mL的淋巴細胞分離液。
2.設備和器具
載玻片、蓋玻片、毛細滴管、試管、熒光顯微鏡、離心機、細胞計數板等。
試驗方法
1.細胞準備
取待檢者肝素抗凝靜脈血2mL，沿離心管管壁緩緩加於2mL淋巴細胞分離液的表麵，勿形成氣泡並保持界麵清晰，2000r／min離心20min。
2.封閉
用毛細滴管吸取富含淋巴細胞的乳白色層於一試管中，加入適量含5％胎牛血清的Hanks液洗3次，每次1500r／min離心10min，棄上清，用Hanks液調整至細胞濃度約為5×106個／mL。
3.染色
取上述濃度淋巴細胞懸液0.1mL，加入等量的熒光抗體，置4℃避光溫育30min。取出後用Hanks液洗兩次，每次1500r／min離心10min，棄上清。
4.封片鏡檢計數
取沉澱細胞於載玻片上，蓋上蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察，計數熒光陽性細胞。
凡呈微弱、均勻一致的暗淡熒光者為熒光陰性細胞，即非B淋巴細胞。凡細胞呈現較強熒光，有明顯的細胞輪廓，並可見環狀或斑點狀或在細胞一側有帽狀結構者，為SmIg陽性細胞，即B淋巴細胞。
計數時可先在紫外光源下計數熒光陽性細胞，再轉換普通光源計數該視野中淋巴細胞總數。每份標本計數200個淋巴細胞，算出熒光陽性細胞百分率。
正常人B淋巴細胞數占外周血淋巴細胞總數的20％左右。
5.注意事項
①熒光標記抗體應於4～8℃冰箱保存，避免反複凍融，使用前新鮮配製。
②標本染色後應立即在熒光顯微鏡下觀察，在染色當天熒光最強、最明顯。如需保存，可放於盒子中，再用塑料袋包住，置於0～5℃保存。也可用50％PBS緩衝甘油封片，但過夜後特異性熒光褪色30％，保存1周褪色50％。
③標本應放在濕盒內避光保存，以防光照使熒光猝滅。
④普通的載玻片、蓋玻片或試劑中的雜質可造成非特異熒光，應注意鑒別。實驗時應避免使用有熒光的玻片或試劑。
⑤紫外光源於使用前半小時預熱，短時間間歇勿關閉光源，一旦關閉紫外光源，需1～2h後才可重新接通使用。
⑥觀察時間不宜過長，當熒光變弱後可轉換視野或重新滴片繼續觀察。
二、直接免疫熒光法診斷豬瘟
任務簡介
豬瘟又稱豬霍亂，是豬的一種高度傳染性疫病，是威脅養豬業的主要傳染病之一。1885年首先在美國發現，以後傳播到世界各大洲。中國大部分省市都有發生，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。
豬瘟病豬的組織中存在大量豬瘟病毒，本實驗是用病豬扁桃體或腎髒組織冷凍切片，或豬瘟脾淋源活疫苗塗片作為檢查對象，加入熒光抗體進行反應，溫育後在熒光顯微鏡下觀察，便可知待檢標本中豬瘟病毒是陽性還是陰性。
通過本任務，要求熟悉直接免疫熒光法的原理和用途；學習直接熒光免疫法診斷豬瘟的方法並了解豬瘟病毒檢測對養豬業的意義。
任務內容
1.所需的材料和設備
（1）材料和試劑
①豬瘟熒光抗體，按說明書稀釋使用。
②固定劑，丙酮。
③PBS緩衝，0.01mol／LpH7.2。
④碳酸鹽緩衝液，0.5mol／L碳酸鈉1份，0.5mol／L碳酸氫鈉3份混合。
⑤緩衝甘油，優級純甘油9份和碳酸鹽緩衝液1份混合而成。
⑥豬瘟脾淋源活疫苗（塗片用）或新鮮豬扁桃體與腎髒組織塊（切片用）。
（2）設備和器具
吸管、載玻片、蓋玻片、濕盒（帶蓋搪瓷盤內鋪濕紗布）、冰凍切片機、熒光顯微鏡等。
2.試驗方法
（1）組織塗片製作
取豬瘟脾淋源活疫苗均勻塗抹載玻片，空氣中自然幹燥後，立刻在室溫下放入純丙酮固定10min，取出後PBS緩衝液輕輕漂洗數次，自然幹燥後即可染色。如不能及時染色，可用塑料紙包好，放入低溫冰箱保存。
組織切片製作方法為：取新鮮豬扁桃體或腎髒組織塊，用冰凍切片機製成5～7μm原冰凍組織切片，粘於清潔的載玻片上（0.8～1.0mm），空氣中自然幹燥後，立刻在室溫下放入純丙酮固定15min，取出後PBS緩衝液輕輕漂洗數次，自然幹燥後染色。如不能及時染色，可用塑料紙包好，放入低溫冰箱保存。
（2）熒光抗體染色
滴加稀釋後的豬瘟熒光抗體2～3滴，以覆蓋為度，放入濕盒中，37℃避光溫育30min（切忌染色液幹涸）。以PBS緩衝液衝洗3次，每次1min。
（3）對照的設置