實驗十八：動物組織中DNA的提取與含量測定
【實驗目的】
（1）掌握從動物組織中提取DNA的實驗原理。
（2）學會從動物組織中提取DNA的實驗技術。
（3）熟悉並掌握離心機的使用方法。
【實驗原理】
DNA是所有生物體的基本組成物質。真核生物DNA主要存在於細胞核中。製備DNA時應將細胞核膜打破方能釋放出來。
細胞中的DNA和RNA分別與蛋白質相結合，形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細胞破碎後，這兩種核蛋白將混雜在一起。因此，要製備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol／LNaCl的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脫氧核糖核蛋白的溶解度則最小（僅約為在純水中的1％）；而在lmol／LNaCl的濃鹽溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在純水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據這種特性，調整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此，在細胞破碎後，用稀鹽溶液，反複清洗，所得沉澱即為脫氧核糖核蛋白成分。
分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質成分變性，讓DNA遊離出來，再用含有異戊醇的氯仿沉澱除去變性蛋白質。最後根據核酸隻溶於水而不溶於有機溶劑的特點，加入95％的乙醇即可從除去蛋白質的溶液中把DNA沉澱出來，獲得產品。
當細胞破碎時，細胞內的脫氧核糖核酸酶（DNase）立即開始降解DNA，如果在破碎細胞後不及時采取抑製酶活的措施，最後將會得不到任何DNA。為此，在本實驗中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除去DNase必需的Mg2＋離子，使DNase活性降低，並要求整個分離製備過程均在4℃以下進行，以減少DNase的降解作用，最後加入SDS使所有的蛋白質（包括DNase）變性。當然如果希望獲得更大分子的DNA時，則在細胞破碎後，及時加入SDS使蛋白質（包括DNase）變性，並加入蛋白酶K，降解所有的蛋白質成為碎片或氨基酸，及時阻止DNase的降解作用。
DNA分子很長，在水中呈黏稠狀，但DNA鏈的雙螺旋結構不宜小角度的折疊，使DNA分子具有剛性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折疊和壓擠等剪切力，將使DNA斷裂成碎片。DNA隻要防止DNase汙染並在高鹽濃度條件下能在液體狀態保存；抽幹後的固體DNA，性質穩定，可長期保存。
生物體內各部位的DNA是相同的，但取材時以含量豐富的部位為主，如動物的肝髒、脾、腎、血液、精子等。所有材料，必須新鮮及時使用，或放入-20℃冰箱或液氮冷凍保存。DNA的含量及純度可用紫外吸收法、定磷法及化學法等測定。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.15mol／LNaCl-0.015mol／LpH7.0檸檬酸鈉溶液：稱取8.77gNaCl，4.41g檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O），用約800mL蒸餾水溶解後，調節pH至7.0，最後定容至1000mL。
（2）0.15mol／LNaCl-0.1mol／LEDTANa2溶液：稱取8.77gNaCl，37.2gEDTANa2溶於約800mL蒸餾水中，以NaOH調pH至8.0，最後定容至1000mL。
（3）50g／L十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液：稱取5gSDS溶於450g／L100mL的乙醇中。
（4）氯仿——異戊醇溶液：按氯仿：異戊醇=24：1配製。
（5）95％乙醇。
（6）冰、粗鹽。
（7）2mol／LNaCl：稱取11.7gNaCl，溶於100mL蒸餾水中。
2.器材
組織搗碎機、玻璃勻漿器、離心機。
【實驗操作】
1.DNA提取
（1）本實驗以兔肝髒作材料（其他動物肝髒也可以）。實驗前應將兔饑餓24h以上，以避免糖原的幹擾。
（2）將經過饑餓的兔頸部放血致死，迅速開腹取出肝髒，稱取約2g浸入預先在冰鹽水中冷卻的0.15mol／LNaCl–0.015mol／L檸檬酸鈉溶液中。除去脂肪、血塊等雜物；再用少量溶液反複洗滌幾次，直至組織塊無血為止。
（3）將洗淨的組織剪成碎塊。先加入7ml0.15mol／LNaCl–0.015mol／L檸檬酸鈉溶液，放在組織搗碎機中迅速搗成勻漿。
（4）勻漿液2500r／min離心15min，棄上清。在沉澱中加入3mL冷的0.15mol／LNaCl-0.015mol／L檸檬酸鈉溶液，攪勻，按上述條件，離心棄上清。如此重複操作2～3次，盡量洗去可溶的部分。最後棄去上清，留沉澱。
（5）將沉澱物（約5mL）懸浮於3mL的0.015mol／LNaCl–0.1mol／LEDTANa2溶液中，攪勻，而後邊攪拌邊慢慢滴加5％SDS溶液，直至SDS的最終濃度達1％為止，此時溶液變得十分黏稠，然後，加入固體NaCl使最終濃度達lmol／L。繼續攪拌30～45min，以確保NaCl全部溶解，此時可見溶液由稠變稀薄。
（6）將上述混合溶液倒於三角瓶中，加入等體積的氯仿——異戊醇，振蕩10min。在室溫2500r／min離心10min，此時可見離心液分為3層：上層為水溶液，中層為變性蛋白塊，下層為氯仿——異戊醇。小心吸取上層水相，記錄體積，放入三角瓶中，再加入等體積氯仿——異戊醇，振蕩，離心，如此重複抽提2～3次，除淨蛋白質。
（7）小心吸取上層溶液（不要吸取下層氯仿），放入小燒杯中，加入2倍體積預冷的95％乙醇。加時，用滴管吸取乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在燒杯內轉動。隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現黏稠狀絲物質，並能逐步纏繞於玻璃棒上，直至再無黏稠絲狀物出現為止。黏稠絲狀物即是DNA。
（8）DNA溶於1ml2mol／L氯化鈉溶液中，留作定量、電泳用。
2.DNA的測定
吸取5μLDNA樣品，用蒸餾水稀釋到1mL（200倍稀釋），以蒸餾水調零，測定樣品的A260和A280，計算出每克肝組織中的DNA含量，並判斷純化DNA的純度。
【結果處理】
DNA樣品的濃度按下式計算：
DNA樣品的濃度=A260×核酸稀釋倍數×50／1000
整理實驗結果，總結實驗經驗。如果A260／A280比值大於1.8說明存在RNA，可考慮用RNA酶處理樣品，小於1.6說明樣品中存在蛋白質，應用酚／氯仿抽提，再用乙醇純化DNA。
【注意事項】
（1）DNA的提取操作應在0～4℃進行。
（2）為保證獲得大分子DNA，操作時應避免劇烈振搖，或過大的離心力。轉移吸取DNA時不可用過細的吸頭，不可猛吸猛放，更不能用細的吸頭反複吹吸。
實驗十九：酵母RNA的提取及鑒定
Ⅰ酵母RNA的提取（濃鹽法）
【實驗目的】
（1）了解RNA提取、定性、定量方法的原理。
（2）學習濃鹽法提取RNA的原理與技術。
【實驗原理】
提取RNA的方法很多，在工業生產上常用的是稀堿法和濃鹽法。前者利用稀堿溶解細胞壁，使RNA釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA在此條件下不穩定，容易分解；後者在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性，使RNA釋放出來，此法易掌握，產品顏色較好。
酵母含RNA2.67％～10.0％，DNA很少（0.3％～0.516％），而且菌體容易收集，RNA也易於分離，所以選用酵母為實驗材料。
RNA提製過程是先使RNA從細胞中釋放，並使它和蛋白質分離，然後將菌體除去。再根據核酸在等電點時溶解度最小的性質，將pH調至2.0～2.5，使RNA沉澱，進行離心收集。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）NaCl。
（2）6mol／LHCl。
（3）95％乙醇。
2.儀器
量筒、三角瓶、燒杯、布氏漏鬥、吸濾瓶、表麵皿、分光光度計、離心機、恒溫水浴、藥物天平、烘箱、pH0.5～5.0的精密試紙。
3.材料
鮮酵母或幹酵母。
【實驗操作】
（1）稱取鮮酵母15g或幹酵母粉2.5g，倒入100mL容量瓶中，加NaCl2.5g，水25mL，攪拌均勻，置於沸水浴中提取1h。
（2）將上述提取液用自來水冷卻後，裝入大離心管內，以3000r／min離心10min。使提取液與菌體殘渣等分離。
（3）將離心得到的上清液傾於50mL燒杯內，並置入放有冰塊的250mL燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時，用6mol／LHCl小心地調節pH至2.0～2.5（注意嚴格控製pH）。調好後繼續於冰水中靜置10min，使沉澱充分，顆粒變大。
（4）上述懸浮液以3000r／min離心10min，得到RNA沉澱。將沉澱物放在10mL小燒杯內，用95％的乙醇5～10mL充分攪拌洗滌，然後在布氏漏鬥上用射水泵抽氣過濾，再用95％乙醇5～10mL洗3次。
（5）從布氏漏鬥上取下沉澱物，放在表麵皿上，鋪成薄層，置於80℃烘箱內幹燥。將幹燥後的RNA製品稱重，存放於幹燥箱內。
【結果處理】
1.含量測定
將幹燥後RNA產品配製成濃度為10～15μg／mL的溶液，在分光光度計上測定其260nm處的吸光度，按下式計算RNA含量：
RNA含量（％）=A2600.024×L×RNA溶液總體積（mL）RNA稱取量×100
式中A260——260nm處的吸光度；
L——比色杯光徑，cm；
0.024——1mL溶液含1μgRNA的吸光度。
2.計算提取率
根據含量測定的結果按下式計算提取率：
RNA含量（％）=RNA含量（％）×RNA製品質量（g）酵母質量（g）×100
【注意事項】
（1）用濃鹽法提取RNA時應注意掌握溫度，避免在20～27℃停留時間過長，因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用活躍的溫度範圍，會使RNA降解而降低提取率。
（2）加熱至90～100℃使蛋白質變性，破壞兩類磷酸酯酶，有利於RNA的提取。
Ⅱ酵母RNA的提取（稀堿法）
【實驗目的】
（1）了解RNA提取、定性、定量方法的原理。
（2）學習稀堿法提取RNA的原理與技術。
【實驗原理】
稀堿法使用稀堿使酵母細胞裂解，然後用酸中和，除去蛋白質和菌體後的上清液用乙醇沉澱RNA或調pH2.5利用等電點沉澱。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA達2.67％～10.0％，而DNA含量僅為0.03％～0.516％，為此，提取RNA多以酵母為原料。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.2％氫氧化鈉。
（2）乙酸（AR）。
（3）95％乙醇。
（4）無水乙醚（CP）。
（5）氨水（CP）。
（6）10％硫酸溶液：濃硫酸（相對密度1.84）10mL，緩緩傾於水中，稀釋至100mL。
（7）5％硝酸銀溶液：5gAgNO3溶於蒸餾水並稀釋至100mL，貯於棕色瓶中。
（8）苔黑酚——三氯化鐵試劑：將100mg苔黑酚溶於100mL濃鹽酸中，再加100mgFeCl3·6H2O。臨用時配製。
2.器材
電子天平、燒杯、量筒、抽濾瓶、布氏漏鬥、吸管、離心機。
3.材料
幹酵母粉（市售）或鮮酵母（市售）。
【實驗操作】
（1）置4g幹酵母粉或30g鮮酵母於100mL燒杯中，加入0.2％NaOH溶液40mL，沸水浴加熱30min，經常攪拌。加入乙酸數滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10～15min（3000r／min）。
（2）取上清液，加入95％乙醇30mL，邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉澱，過濾。
（3）濾渣先用95％乙醇洗2次（每次約10mL），繼續用無水乙醚洗2次（每次10mL），洗滌時可用細玻棒小心攪動沉澱。乙醚濾幹後，濾渣即為粗RNA，可作鑒定。
（4）RNA定性分析
①取上述RNA約0.5g，加10％硫酸液5mL，加熱至沸1～2min，將RNA水解。
②取水解液0.5mL，加苔黑酚——FeCl3試劑1mL，加熱至沸1min，觀察顏色變化。
③水解液2mL，加氨水2mL及5％硝酸銀溶液1mL，觀察是否產生絮狀嘌呤銀化合物（有時絮狀物出現較慢，可放置十幾分鍾）。
【思考題】
（1）所得RNA是否是純品？如何進一步純化？
（2）RNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些？
實驗二十：質粒DNA的微量快速提取與鑒定
【實驗目的】
（1）了解質粒作為載體在基因工程中的應用。
（2）熟記提取質粒的基本原理，學習提取過程和方法。
【實驗原理】
基因工程的重要環節就是如何把外源基因導入到受體細胞中去。外源基因自己很難進入受體細胞中，既是進入受體細胞中，一般也不能進行複製和表達。這是因為我們得到的目的基因不帶有複製子係統和表達調控係統，所以我們必須利用運載工具即載體將外源基因導入到受體細胞中去。
質粒就是一種最常用的載體。質粒（plasmid）是一種染色體外的穩定遺傳因子。大小在1～200kb之間，具有雙鏈閉合環狀結構的DNA分子。主要發現於細菌、放線菌和真菌細胞中。質粒具有自主複製和轉錄能力，能使子代細胞保持它們恒定的複製數，可表達它攜帶的遺傳信息。它可獨立遊離在細胞質內，也可整合到細菌染色體中，它離開宿主的細胞就不能存活，而它控製的許多生物學功能卻賦予宿主細胞的某些表型。