實驗三十五：維生素C的定量測定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）
【實驗目的】
（1）熟悉抗壞血酸的氧化還原性質。
（2）了解本試驗的原理和意義。
（3）掌握定量測定維生素C的方法。
【實驗原理】
維生素C又稱為抗壞血酸，一般水果、蔬菜中維生素C的含量均較高，包括還原型維生素（抗壞血酸）和氧化型維生素C（脫氫抗壞血酸），新鮮樣品中以前者含量最高。維生素C很不穩定，易被堿、熱、光、氧、金屬離子及維生素氧化酶等因素所破壞，在中性和微酸性條件下穩定，故常用草酸、醋酸來提取樣品中的維生素C。維生素C具有很強的還原性，能還原具有氧化性的2，6-二氯酚靛酚，而本身被氧化成脫氫維生素C。因此本法僅能測定還原性維生素C。
氧化型2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈玫瑰紅色，在中性或堿性溶液中呈藍色。當用藍色的堿性2，6-二氯酚靛酚溶液滴定含有維生素C的草酸溶液時，其中的維生素C可以將2，6-二氯酚靛酚還原成無色的還原型。但當溶液中的維生素C完全被氧化之後，則再滴2，6-二氯酚靛酚就會使溶液呈玫瑰紅色，借此可以指示滴定終點，表示溶液中的維生素C剛剛被氧化完。根據滴定消耗的標準2，6-二氯酚靛酚溶液的量，可以計算出被測樣品中維生素C的含量。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）2％草酸。
（2）0.05％的2，6-二氯酚靛酚鈉溶液：稱取2，6-二氯酚靛酚500mg，溶於含碳酸氫鈉104mg的熱蒸餾水中，冷卻後用蒸餾水定容至1000mL，貯於棕色瓶中，4℃下冷藏保存可穩定一周。使用前用標準維生素C溶液標定。
（3）標準維生素C溶液（0.1mg／mL）：稱取維生素C結晶10mg（應為潔白色，如變為黃色則不能用），用2％草酸溶解並定容至100mL（貯於冰箱），最好臨用前配製。
2.器材
錐形瓶、研缽、天平、剪刀、漏鬥、吸管、紗布、微量堿式滴定管、容量瓶。
3.材料
新鮮水果、蔬菜、鬆針等。
【實驗操作】
1.樣品提取
準確稱取新鮮水果或蔬菜樣品1～2g，剪碎後放在研缽中，加入2％草酸溶液約10mL充分研磨，放置5min，將提取液濾入50mL容量瓶。如此反複抽提2～3次，最後用2％草酸溶液定容。
2.2，6-二氯酚靛酚溶液的標定
取4mL標準維生素C溶液（含0.4mg維生素C），置於三角燒瓶內，加6mL2％的草酸溶液，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至呈微紅色（須在1～3min內完成，15s不褪色為終點）。記錄消耗量，計算出每1mL2，6-二氯酚靛酚能氧化維生素C的量（重複3次，取平均值）。
3.樣品滴定
取上述樣品提取液10mL放入錐形瓶內，用微量堿式滴定管以標定的2，6-二氯酚靛酚溶液（藍色）滴定，每滴1滴，充分搖勻，直至呈現微紅色保持15s不褪色為止，記下消耗的體積（重複3次，取平均值）。
4.空白滴定
取10mL2％草酸溶液放入錐形瓶內，用微量堿式滴定管以標定的2，6-二氯酚靛酚溶液（藍色）滴定，每滴1滴，充分搖勻，直至呈現微紅色保持15s不褪色為止。記下消耗的體積（重複3次，取平均值）。
【結果處理】
以上樣品提取液和空白對照滴定取結果的平均值按下式計算：
維生素C（mg／100g樣品）=（V1-V2）×m×VV3×m′×100
式中V1——滴定樣品所用2，6-二氯酚靛酚溶液的平均體積，mL；
V2——滴定空白所用2，6-二氯酚靛酚溶液的平均體積，mL；
V——樣品提取液的總體積，mL；
V3——滴定時所取樣品提取液的體積，mL；
m′——樣品的質量，g；
m——1ml2，6-二氯酚靛酚溶液能氧化維生素C的量，可通過標定計算得到，mg。
【注意事項】
（1）本試驗方法簡便易行，但也有缺點，如樣品中可能還存在另外一些還原性物質，也能使2，6-二氯酚靛酚還原，所以滴定速度要快，2～3min滴定結束，以染料用量不超過4mL為佳，滴定至微紅色15s不褪色即為反應終點。
（2）組織提取液中常有色素存在，會給滴定終點觀察帶來困難，可選用活性炭脫色再滴定。
（3）用2％草酸製備提取液，可有效抑製抗壞血酸氧化酶，而1％草酸無此作用。
（4）提取的漿狀物如不易過濾，可進行離心收集上清液。
【思考題】
（1）利用2，6-二氯酚靛酚法測定維生素C有何優缺點？
（2）維生素C的生理功能都有哪些？
實驗三十六：維生素A的定量測定（比色法）
【實驗目的】
（1）了解三氯化銻比色法測定維生素A的原理。
（2）熟悉比色法測定維生素A的操作步驟。
【實驗原理】
維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用產生藍色物質，其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該藍色物質雖不穩定但在一定時間內可用分光光度計於620nm波長處測定其吸光度，進而得到維生素A的活性含量。
【試劑與器材】
1.試劑
本實驗所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水。
（1）無水硫酸鈉（Na2SO4）。
（2）乙酸酐。
（3）乙醚：不含有過氧化物。
（4）無水乙醇：不含有醛類物質。
（5）三氯甲烷：應不含分解物否則會破壞維生素A。
檢查方法：三氯甲烷不穩定，放置後易受空氣中氧的作用生成氯化氫和光氣，檢查時可取少量三氯甲烷置試管中，加水振搖使氯化氫溶到水層，加入幾滴硝酸銀溶液，如有白色沉澱即說明三氯甲烷中有分解產物。