熱毒寧注射液對大鼠肝髒CYP450酶的影響
中藥毒性研究專題
作者：張雲燕 徐王彥君 湯響林 馬增春 王宇光 梁乾德 譚洪玲 肖成榮 王振中 蕭偉 高月
[摘要]研究熱毒寧注射液對大鼠肝髒CYP450酶酶活性及其mRNA表達水平的影響。將SD大鼠腹腔注射7 d後，處死，製備大鼠的肝微粒體，與探針藥物共孵育，利用LC/MS法測定各同工酶特異性底物在大鼠肝微粒的代謝產物的生成量，間接反映各同工酶的活性。應用熒光定量PCR技術考察熱毒寧注射液對大鼠肝髒CYP450酶mRNA表達水平的影響。結果顯示，酶活性方麵，熱毒寧注射液與空白組比較可抑製CYP2B1，2C12，2C13，2D2的酶活性，誘導CYP3A1的酶活性，對CYP1A2酶活性無明顯影響。mRNA表達方麵，熱毒寧注射液對CYP2B1，3A1，1A2，2C11，2D1，2E1 mRNA的表達具有誘導作用。通過對上述結果分析，可以看出熱毒寧注射液在酶活性和mRNA水平均對CYP3A1具有顯著的誘導作用，與大環內酯類抗生素合用時可能會出現不良反應；對CYP2B1，2C12，2C13，2D2的酶活性均具有抑製作用，與其他藥物聯合用藥時要充分考慮可能出現的藥物相互作用或潛在風險。
[關鍵詞]熱毒寧注射液；細胞色素P450酶；Cocktail探針法；熒光定量PCR技術
Effects of Reduning injection on activity of hepatic microsomal
CYP450 isozymes in rats
ZHANG Yun-yan1， XU Wang-yanjun2， TANG Xiang-lin1*， MA Zeng-chun1， WANG Yu-guang1， LIANG Qian-de1，
TAN Hong-ling1， XIAO Cheng-rong1， WANG Zhen-zhong3， XIAO Wei3， GAO Yue1*
（1. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China；
2. Anhui Medical University， Hefei 230032， China；
3.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China）
[Abstract]To research the influence of Reduning injection on the activity and mRNA expression of cytochrome P450（CYP450） system in rat liver microsomes. Rat liver microsomes were prepared after a seven-days continuous administration of Reduning injection. An HPLC-MS method was applied to determine the specific metabolites of CYP450 probe substrates in rat liver microsomal incubations. The activity of CYP450 isozymes were represented by the formation of metabolites. The Real-time quantitative polymerase chain reaction （Q-PCR） was applied to determine the mRNA expression levels of CYP450. Reduning injection significantly reduced the activity of CYP2B1，2C12，2C13（P
[Key words]Reduning injection； cytochrome P450； Cocktail probe method； Q-PCR
doi：10.4268/cjcmm20151411
熱毒寧注射液處方源於名老中醫經驗方，由青蒿、金銀花和梔子3味藥經現代工藝提取精製而成，是國家二類新藥。熱毒寧注射液具有清熱、解毒、疏風等作用，臨床上用於外感風熱所致感冒、咳嗽，上呼吸道感染及急性支氣管炎等。現代藥理學研究，熱毒寧注射液有解熱、鎮痛、抗病毒、提高機體免疫力、抗菌抗炎等作用[1]。
藥物之間的相互作用主要由細胞色素CYP450 酶係介導，CYP450酶參與了絕大多數內源性和外源性分子的生物代謝過程，尤其是對藥物的代謝。研究中藥對CYP450酶係的影響對保證臨床藥物作用的安全性和有效性具有極其重要的意義[2]。但是，目前關於熱毒寧注射液對藥物代謝酶影響的研究很少。因此，本文將采用Cocktail探針法結合LC/MS技術[3-4]，測定熱毒寧注射液對大鼠CYP450同工酶酶活性的影響，同時利用熒光定量PCR技術[5]對大鼠CYP450同工酶mRNA表達進行檢測，試圖從2個層麵研究熱毒寧注射液對藥物代謝酶亞型的影響，為臨床合理用藥提供依據。
另外，在熱毒寧注射液的臨床試驗中，藥品不良反應發生率為0.38%[6]。熱毒寧注射液不良反應的發生與用藥總量、合並用藥等因素有關，在是否有合並用藥因素中，抗微生物藥、大環內酯類藥物有非常顯著性差異。本文試圖從熱毒寧注射液對大鼠肝髒細胞色素CYP450酶影響的角度解釋熱毒寧注射液產生的不良反應，為熱毒寧注射液的臨床合理用藥提供依據。
1材料
1.1藥品與試劑
熱毒寧注射液（江蘇康緣藥業股份有限公司，批號121122）；非那西丁（phenacetin）、甲苯磺丁脲（tolbutamide）、右美沙芬（dextromethorphan）、咪達唑侖（midazolam）、撲熱息痛（paracetamol）、普萘洛爾（propranolol）均購自中國食品藥品檢定研究院；安非他酮（bupropion）、S-美芬妥因（S-mephenytoin）、4-羥基甲苯磺丁脲（4-OH tobutamide）、右啡烷（dextrorphan）、1′-羥基咪達唑侖（1′-OH midazolam）、4-羥基安非他酮（4-OH bupropion）、4-羥基美芬妥因（4-OH mephenytoin）均購自美國BD公司；NADPH購自瑞士Roche公司；RNA提取試劑盒購自中國Biomed公司；逆轉錄酶及Q-PCR擴增試劑購自中國TransGen公司；甲醇和乙腈為色譜純，購自美國Fisher；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。