一株分離自新疆細蟲草菌核的彎頸黴鑒定及抑菌研究
資源與鑒定
作者：索菲婭 黃羅冬 虞泓
[摘要] 目的：開發利用新疆細蟲草資源，為新疆細蟲草相關真菌的研究和開發利用提供基礎資料。方法：研究從新疆細蟲草菌核中分離得到一種白色菌株，編號為SFYT002，采用形態學觀察和ITS以及18SrDNA測序，在GenBank比對，進行係統進化樹分析，並采用濾紙片法研究其體外抗菌作用。結果：菌株SFYT002主要的特征為菌落白色棉絨狀，瓶梗長在分枝的分生孢子梗上，瓶梗基部膨大，頂部急劇變細，部分頸部彎曲，孢子小且透亮，孢子有出芽現象，常形成聚集孢子頭，分生孢子球形，亞球形至橢圓形。ITS和18SrDNA序列分析表明，彎頸黴屬為單係發生，菌株SFYT002與膨大彎頸黴聚為一支。研究其抑菌作用表明，菌株SFYT002發酵液及其不同極性的提取物對4種常見致病菌，均有很強的抑製作用。結論：通過形態學和分子生物學特征將菌株SFYT002鑒定為膨大彎頸黴，具有較強的抑菌活性。
[關鍵詞]細蟲草；膨大彎莖黴；鑒定；抑菌；新疆
新疆細蟲草Ophiocordyceps gracilis （Grev.）G. H. Sung， J. M. Sung， Hywel-Jones & Spatafora [1]是指蟲草菌寄生在蝙蝠蛾科阿爾泰無鉤蝠蛾Ahamus altaicola Wang.幼蟲，並形成子座及幼蟲屍體的複合體[2-4]，無性型為羽束梗孢Paraisaria dubia（Delacr.）Samson & Brady。新疆細蟲草分布於阿爾泰山脈的雪線以下，分布海拔為1 400～2 100 m，是阿勒泰山脈特有的蟲草資源，為傳統的哈薩克民族藥。索菲婭等[5-6]對新疆細蟲草與冬蟲夏草的化學成分比較分析，發現新疆細蟲草中D-甘露醇的質量分數為120.3 mg·g-1，多糖為3.32%，腺苷為237.7 μg·g-1，均與冬蟲夏草樣品接近，氨基酸的種類含量與冬蟲夏草基本一致。新疆細蟲草一直以來被作為冬蟲夏草的替代品入藥使用，主要功效可保肺腎、補精髓、化痰止勞咳等，被收入新疆維吾爾自治區藥品標準[7]。
本研究從新疆細蟲草菌核分離得到1株出現頻率較高的白色菌株，編號為SFYT002，通過多次傳代培養，對菌株SFYT002進行形態學和分子鑒定，同時對該菌株進行體外抑菌活性測定，對該菌株的活性進行初步分析，旨在為新疆細蟲草相關真菌的開發利用提供基礎資料。
1 材料和方法
1.1 蟲草
2009年8月，新疆細蟲草采自新疆阿勒泰地區阿勒泰林場西伯利亞落葉鬆林下草叢，編號SCALT1007-002，經過多批次分離，從蟲草菌核分離得到非新疆細蟲草無性型的伴生真菌，編號SFYT002，保存於雲南大學中草藥生物資源研究所雲百草實驗室。
1.2 供試菌種
大腸杆菌Escherichia coli，金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，變形杆菌Proteus vulgaris。以上菌種由新疆大學生命科學與技術學院植物資源實驗室提供，用LB培養基培養。
1.3 菌株分離純化
取新疆細蟲草菌核，洗淨，75%乙醇擦洗表麵，並浸泡1～2 min，然後用0.1%的氯化汞溶液浸泡5 min，再用無菌水衝洗3次，將菌核切開，利用鑷子將菌核內菌絲接種於PDA培養基上，24 ℃恒溫培養。
1.4 菌株形態觀察
將分離純化的菌株點接於加有1%蛋白腖的PDA培養基上進行繼代培養，在24 ℃恒溫培養，進行形態觀察。觀測菌株在平板上的生長特征，包括菌落形態、菌絲顏色等。采用載玻片法培養，對菌株進行顯微形態特征的觀察，主要包括菌絲生長特征、孢子大小、顏色、形狀和產孢結構類型等。
1.5 菌株分子鑒定
1.5.1 菌株總DNA的提取 PDA培養基固體培養7 d，於無菌條件下刮取菌絲，采用改良的CTAB法[8]提取菌株總DNA。
1.5.2 菌株ITS序列和18S rDNA序列擴增及測序 ITS（internal transcribed spacer）序列引物為通用引物ITS4和ITS5，18S序列引物利用Primer5自行設計，18SF：5′-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3′，18SR：5′-TCACCAACGGAGACCTTG-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。擴增的反應體係（50 μL）：滅菌去離子水33 μL，10×Buffer （含2 mmol·L-1 Mg2+）5 μL，2.5 mmol·L-1 dNTP 4 μL，二甲基亞碸（dimethyl sulfoxid，DMSO）2.5 μL，10 μmol·L-1 Primer1（正向引物）和Primer2（反向引物） 各2 μL，5 U Taq酶 0.5 μL，DNA模板1 μL。擴增程序ITS為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循環8次，每循環退火溫度降低0.5 ℃；94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循環25次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。18S為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1mins，72 ℃ 2 min，循環8 次，每循環退火溫度降低0.5 ℃；94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環25次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。電泳檢測及PCR產物回收純化，用1%瓊脂糖膠檢測DNA，選取條帶清楚並無雜質的樣品的送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行直接測序。
1.5.3 測序數據處理及分析 獲得測序結果後，對N值和計算機誤讀的個別堿基進行人工修飾。采用BLAST進行序列相似性搜索，從Genbank數據庫下載相關序列。使用ClustalX 2.1將以上序列進行多序列比對，用MEGA5軟件對序列進行統計分析和分支分析，以Kimura雙參數模型計算各序列間的遺傳距離，獲得遺傳距離矩陣以遺傳距陣為基礎構建最大似然法maximum likelihood（ML）分子係統發育樹，用自展法（bootstrap）檢驗係統樹，自展數據集為1 000次。
1.6 菌株抑菌活性研究
1.6.1 菌絲發酵液製備 將菌株SFYT002接種於加有1%蛋白腖的PDA液體培養基， 150 r·min-1，25 ℃條件下培養5～10 d左右，待其搖出明顯的菌絲球長滿整個培養瓶時，過濾，收集上清液，備用。濾得菌絲體烘幹，粉碎，備用。
1.6.2 菌絲提取液製備 參考喬俊霞[9]對不同極性部位提取方法，選取6種不同極性的提取劑製備不同極性的提取物，準確稱取幹燥菌體粉末20 g，加入100 mL提取劑，冷浸24 h，回流提取2次，每次1 h，合並溶劑，旋轉蒸發，製得浸膏，再溶解至10 mL，得質量濃度2 g·mL-1的提取液，4 ℃儲存，備用。
1.6.3 抑菌活性測定 將4種供試細菌先於35～37 ℃活化18 h，打散加至裝有10 mL的無菌水的試管內，振蕩均勻，以無菌水作為對照，用可見分光光度計測其610 nm處的吸光度，調菌懸液A至0.005～0.01，菌懸液的濃度約為1×104～1×105 cfu·mL-1。采用濾紙片法[10]測定抑菌活性，取直徑6 mm的滅菌濾紙片放入菌絲發酵和不同提取液中浸泡，浸泡過夜後將濾紙片貼於含供試菌平板上，每菌重複3次，以10 g·L-1頭孢氨苄做陽性對照，無菌水為陰性對照，測量抑菌圈大小。參照NCCLS/CLIS2006標準[11]和中國衛生部消毒規範[12]判斷抑菌作用結果，抑菌圈直徑10 mm以上為抑菌作用強，7～9 mm為具有中等抑菌活性，6 mm以下為無抑菌活性。
2 結果與分析
2.1 菌株SFYT002形態鑒定
2.1.1 菌落形態觀察 在PDA培養基平板上，25 ℃恒溫培養，菌株培養5 d，菌落呈圓形白色，絨毛狀，直徑0.5～1 cm；培養7 d左右中間絨毛狀蓬鬆，邊緣絨毛狀呈輻射狀，直徑1.5～2 cm；14 d後，菌落直徑4～5 cm，菌落仍為白色，邊緣整齊，菌絲均勻隆起，絨毛變稀少，背麵淡黃色，菌落背麵由初期黃白相間色漸漸變深黃色，外緣呈輻射狀，無滲出液。
2.1.2 培養特征觀察 菌株SFYT002在不同固體培養基上生長的情況，其中在1%蛋白腖PDA上生長速度較快。液體培養時一般不形成小球，菌絲體呈渾濁狀，但在150 r·min-1時，25 ℃培養5 d形成球狀，直徑1～10 mm。
2.1.3 顯微特征觀察果 菌落白色棉絨狀，有氣生菌絲白色，菌絲有隔透明，有突起，菌絲直徑1.2～2.9 μm；分生孢子梗直立，分支1～2次，瓶梗長在分枝的分生孢子梗上，瓶梗基部膨大4.8～12.5 μm×2.1～3.8 μm，頂部急劇變細，最細處寬1.2～1.8 μm，部分頸部彎曲，孢子小且透亮，孢子有出芽現象，形成聚集孢子頭，分生孢子球形，亞球形至橢圓形，小於3 μm。因此，根據形態學顯微特征，菌株SFYT002與彎頸黴屬膨大彎頸黴T. inflatum一致[13]。
2.2 菌株SFYT002的ITS和18SrDNA序列特征及分子鑒定
2.2.1 ITS序列分析結果 測序獲得該菌株ITS總長度469 bp，GC量為57%，其中ITS1 159 bp，GC 56.6%；5.8S rRNA 158 bp，GC 46.9%；ITS2 152 bp，GC 67.7%。經Blast比對，與GenBank登錄號為JQ266196，AY245643的膨大彎頸黴T. inflatum和登錄號為JX488469的Elaphocordyceps subsessilis（Petch）G. H. Sung， J. M. Sung & Spatafora， comb.nov.（無性型為T. inflatum[1]）完全一致，無序列差異，將序列上傳至GenBank中，得到GenBank登錄號為KC963032。為了進一步確定菌株SFYT002的分子關係，在GenBank數據庫中，通過Blast比對，下載與其同源性較高的序列和彎頸黴屬相關種的序列，共27條，以冬蟲夏草ITS序列和實驗室已有的新疆細蟲草（SCALT1007-002）ITS序列（GenBank登錄號為KC963033）為外類群構建係統發育樹。