丹參枯萎病及其病原菌的研究
資源與鑒定
作者：楊立 繆作清 楊光 邵愛娟 黃璐琦 申業 王雪 陳美蘭
[摘要] 丹參是世界公認的治療心腦血管病的首選藥物，栽培丹參枯萎病發生嚴重，嚴重影響栽培丹參產量和質量。針對上述問題，采用形態學和病原學實驗手段對從發生枯萎病丹參植株莖和根中分離得到的病原菌進行鑒定，同時根據ITS序列采用PCR的方法進行進一步確定。結果表明丹參枯萎病多發生7—8月高溫、多雨季節，栽培一年丹參枯萎病的發生率為10%左右，而栽培三年或者三茬丹參枯萎病的發生率達到了60%～70%。枯萎病會引起丹參根腐，因此生產上易誤認為根腐病。形態學鑒定結果表明該病原菌為尖孢鐮刀菌，ITS序列也表明其與黃瓜枯萎病菌的ITS序列同源性為99%。因此，作者認為引起丹參枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。
[關鍵詞]丹參；枯萎病；病原菌鑒定；尖孢鐮刀菌
丹參Salvia miltiorrhiza Bge，俗稱活血根，唇形科多年生草木，以幹燥的肉質根入藥[1]，是世界公認的治療心腦血管病的首選藥物。過去主要以野生為主，20世紀60—70年代的四川、山東、河南、陝西等地廣泛發展種植，並成為丹參主產區[2]。但是藥用植物講究“地道藥材”，具有地域性，對環境條件有著嚴格的要求，因此適宜人工栽培的土地麵積就十分有限。為了滿足市場要求，很難避免重茬連作情況出現。丹參隨著連作和種植年限的延長，根部病害嚴重發生，主要有枯萎病和根腐病[3-4]，2種病害通常混合發生。病菌侵襲丹參植株後會導致植株根係腐爛，葉片枯黃，嚴重時植株大麵積枯死，丹參嚴重減產，有效成分降低[5]。但是目前關於丹參枯萎病病原菌的相關研究極少，隻有王剛雲等報道陝西商洛栽培的丹參枯萎病病原菌主要有尖孢鐮孢和鏈格孢屬[4]。另外，上述的研究結果沒有對病原菌進行係統的研究，特別是沒有致病性試驗結果。本研究采用形態學和分子鑒定等方法並結合致病性測定對丹參枯萎病病原菌進行了研究，旨在為研究丹參枯萎病的診斷和製定防治措施提供參考。
1材料和方法
1.1材料 2010年7月、2010年12月、2011年5月先後3次在山東萊蕪白花丹參Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba種植基地發病嚴重的地塊采集具有典型丹參枯萎病症狀的病株。
1.2病原菌的分離和培養取具有典型丹參枯萎病症狀的病株，按照常規組織分離方法進行病原菌的分離純化：選取根部和莖基部病健交界處以及莖部組織用75%的乙醇消毒3～5 s後，放入0.1%升汞溶液中消毒5 min，再用無菌水衝洗3次後晾幹，用滅菌刀片將帶病組織塊分割成約3～4 mm的小組織塊，接於PDA平板上，每皿4～5小塊，28 ℃條件下黑暗培養5 d後挑取組織塊周圍的菌落轉皿進行純化，對分離物進行歸類、編號和轉管保存[6]。
1.3致病性接種按照柯赫氏法則，采用蘸根接種法[7]對分離物進行致病性測定。將3～5片真葉的丹參健康幼苗根係浸泡在含有1×106個孢子/mL菌懸液中15 min後，置於無菌土中進行栽培，並以無菌水作為空白對照。在25 ℃溫室中進行培養，並觀察記錄發病情況，並對發病後的丹參進行病菌再分離。
1.4病原菌的形態學觀察將病原菌移接於PDA平板上，28 ℃暗培養5 d後，用5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，將菌落轉移至直徑為9 cm的培養皿中央（標準PDA平板），28 ℃下，暗培養5 d後用十字交叉法測量菌落生長直徑，記錄菌落形態特征，在光學顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子和分生孢子梗等菌體形態，並測量其大小。根據病原菌的產孢結構和其他特征及在PDA培養基和綠豆培養基[23]上的形態特征，並依據Booth′s鐮刀菌分類標準進行[8]形態學鑒定。
1.4病原菌的分子鑒定從培養基上直接刮取菌絲體放入1.5 mL 滅菌離心管中，用研磨棒研磨菌絲，采用CTAB法提取菌株DNA[9-10]。采用引物ITS1，ITS2（真菌通用引物）， Fu1和Fu2（鐮刀菌屬特異引物），Fga1和Fga2（編碼尖孢鐮刀菌G蛋白α亞基的基因引物）進行PCR 擴增。25 μL PCR 反應體係包括10 × PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（ 25 mmol·L-1）2.5 μL，dNTP（ 10 mmol·L-1） 0.5 μL，模板DNA 溶液1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，10 pmol·μL-1 ITS1和ITS2引物（由上海生工合成）各0.5 μL，超純水17.3 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最後72 ℃延伸10 min。
擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，BioRad凝膠成像係統觀察、照相。擴增產物經l%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收純化後送北京華大基因工程技術服務有限公司進行測序。測得序列在GenBank數據庫中進行同源性比較。
2結果與分析
2.1田間調查本課題組於2010，2011年對山東萊蕪紫光生態園有限公司的白花丹參種植地進行了病害調查。調查結果表明丹參枯萎病發生的輕重與氣溫高低、雨量大小有關，多發生在5—10月份，特別是7—8月份高溫多雨季節最易發生。隨著連作年限的延長而其發病率增加，栽培一年丹參枯萎病的發生率為10%左右，而栽培三年或者三茬丹參根腐病的發生率達到了60%～70%。受害植株地上部分矮小，葉片逐漸發黃、變褐，莖枝枯萎，表現似缺水症狀，中午萎焉早晚恢複，3～5 d後整個植株枯萎死亡；根係發育較差，須根較少，嚴重時變褐腐爛；主莖及主根維管束變褐。