幾種因素對懸浮培養人參細胞生長和皂苷積累的影響
資源與鑒定
作者：李鐵軍 廉美蘭 於丹 邵春繪 樸炫春
[摘要] 為了完善人參細胞懸浮培養體係，論文研究了人參細胞懸浮培養的動態，探明了培養瓶瓶蓋透氣濾膜的有無，搖床轉速和接種量對人參細胞生長和皂苷積累的影響。結果表明人參細胞懸浮培養過程中，細胞生物量和皂苷產量在培養20 d時達到最大值，因此，可將培養期定為20 d。培養瓶蓋上有透氣濾膜時有利於人參細胞生長和皂苷合成；懸浮培養時搖床轉速影響細胞生長但對皂苷合成無影響，轉數為120 r·min-1時，皂苷生產量最高。每個培養瓶接種6 g鮮重的細胞時，細胞生長和皂苷積累明顯好於其他接種量，總皂苷質量分數達12.8 mg·g-1DW，生產量達146.6 mg·L-1。
[關鍵詞]人參細胞；透氣膜；搖床轉數；接種量
人參Panax ginseng C. A. Meyer是五加科人參屬的多年生藥用植物，主要活性成分人參是皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高人體免疫力及延緩衰老等功效[1]。目前，人參栽培以播種作為主要繁殖方式，從播種到收獲需要4～6年的時間，管理成本較高，病害嚴重，且因為防治這些病蟲害頻繁使用的農藥帶來的殘留問題降低了人參產品質量[2]，同時阻礙其向國外市場出口。因此，利用植物細胞培養工程手段，通過細胞、組織或器官培養獲得人參皂苷便成了解決這些問題的有效方法。
人參細胞和組織培養興起於20世紀60年代，其工廠化生產始於20世紀80年代[3]。在進行人參細胞培養過程中，利用液態培養基進行的懸浮培養被認為是一種取代傳統固態培養基進行培養的方式，其優勢在於細胞增殖速度快，可提供大量均勻一致的培養物[4]。因此，懸浮培養成為植物組織培養走向工業化的必經步驟[5]。由於人參市場的需求量逐年增加，工廠化生產過程中提高人參有效物質的積累越來越受到人們的關注[6]。本試驗調查了人參細胞懸浮培養過程中細胞生長和底物消耗的動態，研究了培養瓶的換氣條件、搖床轉數及接種量對細胞生長和皂苷積累的影響，旨在完善人參細胞懸浮培養技術，為人參皂苷的工廠化生產提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料培養將在長白山區采集的5年生新鮮人參根部洗淨，用洗衣粉稀釋液中清洗5 min，然後在流水下衝洗5 h。將洗淨的人參根在無菌狀態下用70%乙醇浸泡1 min，再用2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，最後用無菌水衝洗3～4次。將已消毒的人參根切成1 cm×1 cm的小塊接種在MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 6.5 g·L-1的培養基中誘導愈傷組織。將誘導出的愈傷組織轉接到含30 mL培養基（MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+激動素（KT） 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +瓊脂6.5 g·L-1）的培養皿（9 cm×1.5 cm）中進行繼代培養。繼代培養3次後，將愈傷組織用刀打碎後接種至含50 mL液態培養基（MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1）的250 mL的三角瓶中，在轉數為100 r·min-1的搖床上培養。培養溫度為（25± 2）℃，相對濕度70%，暗培養。培養20 d後將細胞和培養基的混合液用濾紙過濾後，收集細胞用於實驗材料。
1.2人參細胞生長和皂苷積累及物質消耗動態研究將懸浮培養的細胞稱取4 g鮮重（FW），接種到含50 mL培養基（MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1）的250 mL的三角瓶中，在轉速為100 r·min-1的搖床上培養。培養溫度為（25±2）℃，相對濕度70%，暗培養。培養過程中，每隔5 d停止培養其中一個培養瓶，用濾紙過濾混合物，收集濾紙上的細胞稱鮮重，收集培養基測糖及無機鹽濃度。將測完鮮重的細胞放入50 ℃烘幹箱中，待完全幹燥後（2 d）記錄幹重，並測定皂苷含量。
1.3培養瓶換氣膜的有無對懸浮培養細胞生長和皂苷積累的影響將4 g人參細胞接種到250 mL的三角瓶中，培養基量為50 mL。培養瓶蓋分別用有透氣過濾膜（φ= 1 cm）和無透氣過濾膜的鋁箔紙封蓋，每組接種3瓶，20 d後調查細胞鮮重和幹重，測定皂苷含量。培養條件與1.2相同。
1.4搖床轉速對細胞生長和皂苷積累的影響根據1.3的結果，培養瓶用有濾膜的鋁箔紙封蓋後進行培養，每個培養瓶中細胞的初始接種量為4 g。為了探明搖床轉數的影響，將接種的培養瓶分別置於轉數為80，100，120 r·min-1的搖床上，20 d後對細胞生物量和皂苷含量進行測定。培養基和培養條件與1.2相同。
1.5接種量對人參細胞生物量及皂苷積累的影響為探明接種量對人參細胞生長和皂苷積累的影響，在每個培養瓶中分別接種2，4，6，8 g人參細胞，用有濾膜的瓶蓋封蓋後，將搖床轉數調節為120 r·min-1後培養。其他條件同1.3。
1.6皂苷及糖和陰陽離子濃度測定不定根中人參皂苷測定：按《中國藥典》方法[7]，取人參細胞幹燥粉末（過100鉬篩）1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷約100 mL，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮幹溶劑，連同濾紙筒移人具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中蒸幹，殘渣加甲醇溶解並轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得待測樣品。待測樣品利用配有C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Theromo scientific，美國）的高效液相色譜（LC-15C，島津公司，日本），在紫外可見檢測器（SPD-15C，島津公司，日本）203 nm波長處進行檢測；進樣量為10 μL，流動相為乙腈與水，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。人參皂苷對照品Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1由成都曼斯特生物科技有限公司提供。總皂苷含量為單體皂苷之和，皂苷生產量=細胞幹重× 20 × 皂苷含量。測定人參皂苷含量的流動相洗脫條件參照Wu等[8]方法，流動相水-乙腈，梯度洗脫程序為0～10 min，75%水；10～15 min，68%水；15～20 min，45%水；20～25 min，40%水25～40 min，0 水；40～50 min，75%水。
培養基中糖及離子濃度的測定：將收集的培養液，用過濾器（濾膜孔徑0.2 μm）過濾，稀釋10倍後利用Lian[9]等的方法分別利用配有C18色譜柱（7.8 mm×300 mm， 5 μm， Waters Co.， Milford，美國），IC-Par Anion HR 色譜柱（4.6 mm×75 mm， 5 μm， Waters Co.， Milford，美國）和IC-Par CM/D 色譜柱（3.9 mm×50 mm， 5 μm ， Waters Co.， Milford，美國）的高效液相色譜儀（LC-15C，島津公司，日本）測定培養基中殘留的糖濃度和無機鹽的陰陽離子濃度。糖濃度測定流動相為乙腈-水 80∶20，陽離子濃度測定流動相為0.5 mmol·L-1 EDTA與2 mmol·L-1 HNO3的混合液，陰離子濃度測定流動相為1.6 mmol·L-1 NaHCO3與1.4 mmol·L-1Na2CO3混合液，流速均為1.0 mL·min-1。