脫落酸對鐵皮石斛Ty1—copia類反轉錄轉座子轉錄活性的影響
資源與鑒定
作者：李聰 斯金平 高燕會 朱玉球 蔣園
[收稿日期] 2013-10-29
[基金項目] 浙江省重大科技專項（2012C12912，2011C12002）
[通信作者] *高燕會，副教授，從事植物生物技術和品種選育，E-mail
[作者簡介] 李聰，碩士研究生，E-mail：
[摘要] 研究以Ty1-copia類反轉錄轉座子反轉錄酶區域的簡並引物，對100 μmol ·L-1脫落酸（ABA）處理的鐵皮石斛進行反轉錄PCR（RT-PCR）擴增，得到260 bp左右的目的條帶，說明100 μmol·L-1的ABA能誘導Ty1-copia類反轉錄轉座子轉錄活性的表達。將目的條帶回收、克隆和測序後分析得到42條Ty1-copia類反轉錄轉座子反轉錄酶的保守序列，該序列變異性較大，核苷酸序列長度247～266 bp，同源性為46.3%～98.9%。經plantCARE軟件分析發現與鐵皮石斛基因組所分離的Ty1-copia類反轉錄轉座子一樣，存在多個受脅迫條件作用的調控元件、多個啟動子的特征結構TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些調控元件；但有轉錄活性的鐵皮石斛Tyl-copia RT序列中與脅迫條件作用相關的調控元件明顯增加。翻譯成氨基酸後，有15條序列出現不同程度的終止密碼子突變，19條序列出現移碼突變，保守序列“SLYGKQ” 全部發生不同程度的突變。其氨基酸序列經過係統聚類後可分為5類；且與基因組Tyl-copia RT序列聚類後發現多數發生轉錄的Tyl組反轉錄轉座子RT序列與基因組Tyl組反轉錄轉座子RT序列親緣關係較遠，說明經ABA誘導後發生轉錄的Tyl組反轉錄轉座子RT序列與基因組Tyl組反轉錄轉座子RT序列有很大的差異。
[關鍵詞] 鐵皮石斛； 脫落酸（ABA）； Ty1-copia類反轉錄轉座子； 反轉錄酶（RT）； 轉錄活性
反轉錄轉座子廣泛存在於植物基因組中[1]， 能夠增加基因組大小，對植物基因組進化也會產生重要作用[2]。由於反轉錄轉座子是以DNA-RNA-DNA進行增殖的轉座元件，轉錄便成為控製其活性表達的關鍵步驟。一般情況下，反轉錄轉座子以靜止狀態存在於植物中，但部分反轉錄轉座子仍具有轉座潛能，能夠被各種生物和非生物脅迫所激活[3]，如包括原生質體分離、組織培養、外傷、脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）等非生物脅迫能夠大大提高Tntl和Ttol反轉錄轉座子的表達[4-5]。同時許多生物因素也可以導致反轉錄轉座子的轉錄激活[6]。Tang等[7]在小麥Triticum aestivum L.中發現反轉錄轉座子TaRT-1能夠被MeJA，SA及白粉病菌（powdery mildew fungus）誘導，其表達水平明顯提高。此外，用乙烯，MeJA，SA，ABA等與脅迫相關的信號分子處理液能夠激活其活性。
鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是傳統名貴珍稀中藥材，現代藥理研究表明具有益胃生津、滋陰清熱等獨特功效[8]。20世紀90年代以來，鐵皮石斛組織培養、設施栽培等一係列關鍵技術取得了重大突破，鐵皮石斛產業取得了跨越式發展[9-11]。但鐵皮石斛設施栽培存在生產成本高、環境非友好、病害易發生等問題。針對上述問題，浙江省鐵皮石斛產業技術戰略聯盟發明了鐵皮石斛原生態栽培技術，而選育抗逆性品種是實現原生態栽培的關鍵[12]。因此，本文通過鐵皮石斛脫落酸（ABA）對其基因組內Ty1-copia類反轉錄轉座子轉錄活性的影響及具有轉錄活性的該類反轉錄轉座子的特征研究，了解反轉錄轉座子抗逆機製，以期為鐵皮石斛選育抗逆品種提供依據。
1 材料
供試鐵皮石斛種質C15，經浙江農林大學天然藥物研發中心斯金平教授鑒定為鐵皮石斛D. officinale，原產浙江臨安（30°31′N，119°12′E），係鐵皮石斛分布的北緣，具有抗寒優勢。
DNA Ex Taq酶，MgCl2，10×Buffer ，dNTPs，克隆載體pMD18-T Vector，RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）試劑盒，cDNA合成試劑盒均購自TaKaRa公司；克隆用大腸杆菌DH5α為本實驗室保存；凝膠回收試劑盒購自XYGEN生物技術（杭州）有限公司；引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2 方法
2.1 材料處理
取供試種質種子，在浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地組培室組織培養（光周期 16 h·d-1，溫度 25 ℃），培養180 d時取生長良好、發育狀態一致的組培苗，從莖基部迅速切斷，將組培苗插入蒸餾水中2 h以消除傷害脅迫，然後將組培苗置於濃度為100 μmol ·L-1的ABA溶液中處理，處理時間分別為30，60，120，180，240 min[13]。取未經過ABA處理的組培苗作為空白對照。然後將鐵皮石斛葉片置液氮迅速冷凍，用於RNA提取。
2.2 鐵皮石斛RNA的提取
參照李東賓等[14]改良CTAB的方法提取鐵皮石斛RNA，純度和濃度用分光光度計（Nanodrop 2000）檢測，完整性用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.3 RT-PCR
2.3.1 反轉錄 將對照組RNA和ABA誘導組RNA（將100 μmol ·L-1ABA不同時間段處理後的材料所提取的總RNA等量混合所得），分別用Takara公司的反轉錄試劑盒對RNA進行反轉錄。
2.3.2 RT- PCR反應 根據GenBank中Ty1-copia類LTR反轉錄轉座子RT基因的保守區特點，選擇了Kumar等[15]針對Ty1-copia類LTR反轉錄轉座子RT序列設計的簡並引物對Ty1-F（5′-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3′）和Ty1-R（5′-ARCATRTCRTCNACRTA-3′）；內參基因為鐵皮石斛Actin基因： actin-F（5′- TTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGT -3′）和actin-R（5′-TTTCCCGTTCTGCTGTTGTTGTGAA-3′）；引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
RT-PCR反應體係（20 μL）：10×Buffer 2 μL；25 mmol·L-1 Mg2 +1.2 μL；2.5 mmol·L-1 dNTPs 0.8 μL；10 μmol·L-1引物（Ty1-F和Ty1-R）0.8 μL；5 U·μL-1Taq酶0.1 μL；cDNA模板 4 μL。RT-PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性 1 min，94 ℃變性 1 min，46.5 ℃退火 1.45 min，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸 5 min。其中目標基因35個循環，內參基因25個循環。
2.4 PCR 產物回收、克隆及測序
用1%瓊脂糖凝膠檢測擴增產物，並用凝膠回收試劑盒回收並純化PCR產物，直接將回收產物連接於pMD18-T載體（TaKaRa公司）上，轉化大腸杆菌DH5α轉化感受態細胞，37 ℃培養12～16 h進行藍白斑篩選，挑取白色克隆於含有50 mg·L-1 氨苄青黴素的LB液體培養基中培養4～6 h後，PCR鑒定陽性克隆。將鑒定為陽性的菌液分別取300 μL，由上海生工生物工程（上海）股份有限公司測序。
2.5 反轉錄酶序列分析
測序結果通過NCBI中BLAST程序進行同源性比對，采用Clustal X軟件進行多重比對，用MEGA 5.0軟件鄰接法構建係統發育進化樹。
3 結果與分析
3.1 ABA處理LTR反轉錄轉座子的RT-PCR擴增
從RT-PCR擴增Tyl組反轉錄轉座子RT基因的結果來看，所得的擴增譜帶明顯、無雜帶，片段大小在260～270 bp，與預期目的片段大小一致；經100 μmol·L-1ABA誘導後的擴增譜帶明顯強於空白對照的擴增譜帶，說明100 μmol·L-1ABA對鐵皮石斛中Ty1-copia類反轉錄轉座子的轉錄有明顯誘導作用。將經ABA誘導所得的RT-PCR產物經片段回收、克隆並測序，經Blast比對和DNAstar分析後，共獲得 42條有轉錄活性的反轉錄轉座子反轉錄酶的保守序列。
M. DNA Marker；CK.未經ABA處理的鐵皮石斛RNA擴增；ABA.經ABA處理30，60，120，180，240 min的鐵皮石斛RNA混合樣擴增。
3.2 ABA誘導後具有轉錄活性的鐵皮石斛Ty1-copia類反轉錄轉座子序列分析