葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束口腔速溶膜的製備、表征和抗腫瘤活性研究
製劑與炮製
作者：於超 肖雲芝 徐平華 戴領 韓晉 袁海龍
[收稿日期] 2014-01-17
[基金項目] 北京市自然科學基金項目（7122176）；教育部歸國人員啟動基金項目（20101561）；國家“重大新藥創製”科技重大專項（2013ZX09J13109-06C）
[通信作者] *韓晉，Tel：（0791）66933225，E-mail；*袁海龍，Tel：（0791）66933367，E-mail
[作者簡介] 於超，碩士研究生，E-mail
[摘要] 該研究製備了葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束的口腔溶吸膜，考察了葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束利用口腔速吸膜固化前後的包封率、粒徑、Zeta電位、多分散性係數、膜劑的外觀形態、崩解時限以及葫蘆素B在小鼠的體內藥效學性質。該研究中製備的速溶膜外觀呈均勻的淡黃色，可以在30 s內完全崩解，固化後的葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束在室溫下儲存120 d後，包封率、粒徑、Zeta電位和多分散性係數分別是（43.36±2.12）%，（108.82±5.28） nm，（-34.18±1.07） mV，0.088±0.012；未固化的葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束則分別是（41.26±2.22）%，（181.82±4.48） nm，（-30.67±0.81） mV，0.092±0.012。包封在磷脂膽酸鹽混合膠束後，葫蘆素B溶解度明顯提升。相較於葫蘆素B混懸液，包封在磷脂膽酸鹽混合膠束中葫蘆素B對腫瘤細胞的生長抑製率明顯提升。利用口腔速溶膜固化前後葫蘆素B磷脂膽酸鹽混合膠束對小鼠腫瘤的抑製率沒有明顯改變，分別是（93.17±0.43）%，（93.24±0.21）%。實驗結果說明說磷脂膽酸鹽混合膠束可以有效提高葫蘆素B在小鼠體內的抗腫瘤活性，利用口腔速吸膜固化後膠束穩定性明顯提高且葫蘆素B的藥效學性質沒有明顯改變。
[關鍵詞] 難溶性藥物；葫蘆素B；膠束；口腔速溶膜；固化；藥效學
葫蘆素B（cucurbitacin B，CU）是一種從葫蘆科等植物中分離得到的極具潛力的抗腫瘤活性物質。但CU不溶於水，口服吸收不佳，且對胃腸道有刺激作用[1]。本研究利用磷脂膽酸鹽混合膠束（sodium deoxycholate/phospholipid mixed micelles ，SDC/PL-MMs）增大CU的溶解度，提高胃腸道中的吸收，並可降低對胃腸道的刺激，是一種理想的載藥係統[2-5]。但SDC/PL-MMs是液體製劑，長期儲存膠束顆粒容易聚集沉降，故需固化。口腔速溶膜是一種與口腔速崩片相似的給藥係統，但製備更簡單、經濟。難溶性藥物製成口腔速溶膜存在載藥量不均一的問題[6]。口腔速溶膜和SDC/PL-MMs 2種劑型結合可以使2種劑型優勢互補。本研究探討了結合使用2種劑型對CU在小鼠體內抗腫瘤活性的提高以及綜合使用時製劑的穩定性。
1 材料
超聲儀（KQ-100E， 昆山市超聲儀器有限公司）；磁力攪拌器（85-2， 常州國華儀器有限公司）；Zeta粒度儀（3000SH，英國馬爾文儀器有限公司）；透射電鏡（Tecnai G2 F30，荷蘭FEI公司）；高效液相色譜儀（LC-20A泵，SPD-20A檢測器，日本島津公司）
葫蘆素B（質量分數>60%，南京澤朗醫藥科技有限公司）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，西安海欣製藥有限公司）；磷脂（質量分數>95%，上海愛康精細化工有限公司）；去氧膽酸鈉（上海研生生化試劑有限公司）；羥丙甲基纖維素（HPMC，K-50，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；低取代羥丙基纖維素（L-HPC，HL-21，上海昌為醫藥輔料技術有限公司）；微晶纖維素（MCC，西安北方惠安精細化工有限公司）；PEG400（遼陽華興藥用輔料廠）；高效液相色譜用甲醇為色譜純甲醇（美國Promptar公司）；其他試劑均為分析純。
昆明小鼠，雄性，18～20 g，北京軍事醫學科學院動物實驗中心提供，動物合格證號SCXK-（軍）2012-0004。
2 方法
2.1 CU-SDC/PL-MMs的製備 0.74 g磷脂用20 mL乙醇溶解後，在氮氣下吹幹大部分有機溶劑，再常溫置於真空幹燥箱中除去微量的有機溶劑，即製成脂膜。之後用100 mL PBS（pH 7.4）將0.62 g脫氧膽酸鈉溶解製成膽鹽溶液，將脂膜與膽鹽溶液在45 ℃水浴中超聲混合45 min，即得澄清透明的空白SDC/PL-MMs。之後將過量的CU添加到空白SDC/PL-MMs溶液中，以氮氣密封，使用磁力攪拌器在室溫下攪拌24 h後，用0.45 μm微孔濾膜過濾除去多餘藥物粉末即得CU-SDC/PL-MMs [7]。
2.2 CU-SDC/PL-MMs速溶膜的製備 將4.02 g HPMC加入40 mL的CU-SDC/PL-MMs溶液中，在60 ℃的水浴中使之溶脹形成透明的黏稠液體，之後依次加入0.46 g L-HPC，0.12 g MCC，1 mL PEG400，同時高速攪拌使之混合均勻，真空除去氣泡後在光滑表麵鋪展成一層厚約0.15 mm的薄膜，在真空幹燥箱中幹燥後即得CU-SDC/PL-MMs速溶膜[8]。
2.3 CU-SDC/PL-MMs速溶膜崩解時限的考察 取6片2 cm×2 cm的CU-SDC/PL-MMs速溶膜，參考《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩA中的方法進行崩解時限的考察，平行測定3次。
2.4 CU-SDC/PL-MMs穩定性的考察 使用Zeta粒度儀測定CU-SDC/PL-MMs的粒徑（Z-AVE）、多分散性係數（PI）和Zeta電位。測量的固定角度90°，測定溫度25 ℃。測量前將樣品用雙蒸水溶解稀釋，使膠束顆粒達到所需的濃度以用於分析。各樣品平行測定3次。
固化前後CU-SDC/PL-MMs的包封率采用高效液相法測定。色譜條件：Pinnacle DB C18色譜柱（4.5 mm×250 mm，5 μm），預柱Alltima C18柱（4 mm×20 mm，5 μm）。柱溫25 ℃，DAD檢測波長228 nm。流動相甲醇-去離子水（68∶32）；流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL。
包封率測定的具體步驟：取靜置CU-SDC/PL-MMs溶液的上清液過0.45 μm微孔濾膜，向濾液中加入甲醇，在超聲儀中超聲20 min，徹底破壞CU-SDC/ PL-MMs的膠束結構之後在離心機中以16 000×g的轉速離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜後，注入HPLC儀中。固化在速溶膜中的CU-SDC/PL-MMs實驗前需用適量雙蒸水將其溶解，其餘步驟與上述相同。各樣品平行測定3次。包封率=膠束中的載藥量/總加藥量×100%。