補中益氣湯對肺腺癌順鉑耐藥細胞株移植瘤裸鼠脾、胃和肺中PI3K和AKT表達的影響
藥理
作者：劉亞莉 王瑩 易佳麗 井歡 劉春英
[收稿日期] 2013-11-04
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81072743）；遼寧省教育廳項目（L2010355）
[通信作者] *劉春英，Tel：13604062018，E-mail
[作者簡介] 劉亞莉，副教授，E-mail
[摘要] 目的：探討補中益氣湯對肺腺癌順鉑耐藥細胞株移植瘤裸鼠脾、胃、肺中PI3K/AKT信號通路的影響。方法：60隻裸鼠隨機分為：空白對照組、荷瘤對照組、順鉑組、補中益氣湯低、中、高劑量組。分別給予相應幹預後，測量移植瘤體積，計算抑瘤率。應用免疫組化，Real-time PCR方法檢測裸鼠脾、胃、肺組織中PI3K，AKT蛋白和基因的表達水平。結果：不同濃度的補中益氣湯聯合順鉑能抑製移植瘤的生長，其中以中、高劑量組的抑製作用最強；荷瘤裸鼠的脾、胃、肺中PI3K，AKT蛋白和基因的表達均升高，以荷瘤對照組升高最顯著，隨著應用順鉑和補中益氣湯濃度的增加，PI3K，AKT的表達逐漸降低，在脾、胃組織中與荷瘤對照組比較有統計學差異（P[1] ，降低細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及其下遊分子蛋白激酶B（AKT）的表達，可協同或增加順鉑對A549/DDP細胞的抑製作用，降低對順鉑的耐藥性；體內研究表明不同濃度的補中益氣湯灌胃後，可抑製移植瘤體積的增加，並降低瘤體內PI3K和AKT蛋白和基因的表達。臨床研究表明補中益氣湯配合化療治療可改善患者食欲及消化道的惡心、腹脹、腹痛等症狀[2]。本研究旨在探討補中益氣湯改善消化道症狀是否與其改變脾、胃、肺中PI3K/AKT信號通路有關。
1 材料
1.1 動物及細胞株 BALB/C裸鼠60隻，SPF級，5周齡，雌雄各半，體重（20±2） g，購自北京維通利華動物實驗技術中心，動物許可證號SCXK（京）2012-0001；A549/DDP細胞株（批號）購自中國醫學科學院腫瘤研究中心細胞庫。
1.2 藥物與試劑 補中益氣湯藥物組成有黃芪18 g，甘草9 g，人參6 g，當歸3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術9 g，全部藥材購於遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房，經遼寧中醫藥大學藥理實驗室鑒定後，按成人日推薦量的2，1，1/2倍設置高、中、低劑量組。常規煎煮、過濾、水浴蒸發至每毫升含生藥3.939，1.970，0.985 g，冷卻後保存。
順鉑購自齊魯製藥廠（批號2030132DB）；DMEM培養液，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；PI3K，AKT抗體購於南京凱基生物技術有限公司；Triozol Reagent（美國Invitrogen Life technologies公司）；PI3K，AKT熒光定量PCR試劑盒購於寶生物工程（大連）有限公司；引物合成由北京華大基因公司提供。
2 方法
2.1 動物飼養 BALB/C裸鼠飼養於屏障級的實驗動物中心，喂食高壓滅菌飼料，純淨水，保持12 h光照。
2.2 細胞培養 將A549/DDP置於含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養箱溫度為37 ℃，5%CO2，觀察細胞生長狀態，2～3 d換液1次，4～6 d用0.25%胰酶消化後傳代。收集生長良好的耐藥細胞，以PBS洗滌，調整細胞濃度為5×106個/mL，製備成A549/DDP細胞懸液。