含朱砂的萬勝化風丹和氯化汞對大鼠腎轉運體、腎汞蓄積和Kim—1表達的影響
藥理
作者：朱瓊妮 陸遠富 時京珍 吳芹 張鋒 石京山 劉傑
[收稿日期] 2013-10-31
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81160415）；貴州中藥現代化專項（2010-5）；藥物代謝平台項目（新藥藥理與毒理023）；研究生教育創新基地（黔科 2008-002）；遵義醫學院博士啟動基金（F-582）
[通信作者] *陸遠富，教授，博士，研究生導師，主要從事藥物代謝與藥物毒理研究，Tel：（0852）8609623，E-mail
[作者簡介] 朱瓊妮， 碩士研究生，E-mail
[摘要] 研究含朱砂的萬勝化風丹（WSHFD）和氯化汞對SD大鼠腎汞攝取轉運體（Oat1， Oct2），腎汞外排轉運體（Mrp4， Mate2k）、腎汞蓄積和腎損傷分子1（Kim-1）的影響。發現含汞10倍量的萬勝化風丹古方對大鼠腎汞蓄積及腎毒性遠小於HgCl2，且其對腎轉運體的作用小於HgCl2。而上述各指標在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3組無顯著差異，表明在萬勝化風丹中減量或去掉朱砂對其腎汞蓄積和腎毒性影響不大。
[關鍵詞] 萬勝化風丹； 氯化汞； 腎汞； 腎轉運體； Kim-1
含朱砂的萬勝化風丹曾是受保護的四大名藥之一，由天麻、僵蠶、全蠍、天南星、荊芥、紫蘇葉、蒼術、雄黃、藥母、麝香、檀香、朱砂、硼砂、巴豆霜、冰片等15味中藥經獨特的下窖發酵及風幹工藝製作而成，用來治療中風等疾病[1]。古方萬勝化風丹含朱砂約為10%，朱砂為含汞化合物，其毒性備受人們關注[2-3]。近年來根據藥典規定將朱砂用量減少約2/3，稱為現代配方[4]。2013年5月，同仁堂40餘種中成藥因含朱砂（汞）超標，被香港衛生局禁售。但在中國大陸的中藥店裏，含朱砂的中成藥比比皆是。含朱砂的中藥真有那麼毒嗎？不含朱砂或將朱砂減量的萬勝化風丹毒性會減少嗎？腎髒是無機汞毒性的主要靶器官，故本實驗用高於臨床用量的萬勝化風丹古方（WSHFD3），減量方（WSHFD2）和不含朱砂的方藥（WSHFD0）與HgCl2（約10%古方汞量）口服給藥1周，比較其腎汞蓄積，腎轉運體及腎髒毒性基因表達，為含朱砂的萬勝化風丹的安全用藥提供毒理實驗基礎。
1 材料
1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體重（180±40） g，由重慶市第三軍醫大學提供，許可證號SCXK（渝）2012-005，飼養於清潔級動物中心，合格證號SYXK2011-004，適應1周後給藥。
1.2 藥品與試劑 萬勝化風丹古方藥，現代配方和不含朱砂的方藥由貴州省萬勝製藥有限公司提供。氯化汞（美國Sigma公司）；Trizol，PCR引物[寶生物工程（大連）有限公司]；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（美國Applied Biosystems公司）； iQTM SYBRGreen SuperMix（美國BIO-RAD公司）；mRNA純化試劑盒（上海華舜生物技術有限公司）。
1.3 儀器 KCHG AFS-230E AFS雙通道原子熒光光譜儀（北京科創海光）；實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）；多功能梯度PCR儀（德國Eppendorf）；全波長酶標儀（美國Thermo）；5417R型冷凍離心機（德國Eppendorf）；X-15R型冷凍離心機；Icycler IQ型實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）。
2 方法
2.1 動物分組與給藥 30隻雄性SD大鼠隨機分為5組，每組6隻：萬勝化風丹不含朱砂組（WSHFD0，1.5 g·kg-1）、萬勝化風丹現代配方組（WSHFD2，1.5 g·kg-1，含Hg 45.3 mg·kg-1）、萬勝化風丹原方組（WSHFD3，1.5 g·kg-1， 含Hg 129.3 mg·kg-1）、氯化汞（HgCl2，18 mg·kg-1，含Hg 13 mg·kg-1）。氯化汞組含汞量約為古方組的10%。各組口服灌胃給藥連續7 d，空白對照組給予等體積雙蒸水。
2.2 腎指數測定 大鼠處死取出腎髒後，立即用濾紙擦幹表麵殘血，稱重，以相應質量計算出腎髒指數。腎髒指數=腎髒質量（mg）/體重（g）×100。
2.3 腎組織中汞蓄積量測定 稱取約100 mg腎組織於消化罐中，加入5 mL濃硝酸，180 ℃烘箱中消化2 h，取出後用去離子水定容至50 mL。在貴州省理化測試中心用雙通道原子熒光光度計進行檢測。標準曲線的繪製方法同上，分別吸取10 mg·L-1的汞標準液稀釋至0，2，4，6，8，10 ng·kg-1後立即進行測定。標準曲線Y=105.500X+4.933，r=0.998 3。
2.4 Real-time PCR檢測相關基因的表達 取腎組織50～100 mg於1 mL Trizol中，提取肝髒總RNA，測定其濃度及純度，按照試劑盒說明書提取並純化RNA， 並分別在260，280 nm處測其吸光度，A260/A280均在1.8～2.0。逆轉錄為cDNA後進行聚合酶鏈反應。以GAPDH為參照，引物序列。用相對量法計算腎損傷相關基因Kim-1，MT-1，MT-2及轉運體相關基因Oct2，Oat1，Mate2k，Mrp4 mRNA的表達水平。以Ct為統計參數，采用目的基因及GAPDH相對含量的比值作為評價標準，對實驗中目的基因進行相對定量。
2.5 統計學處理 實驗數據以±s表示，應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊采用LSD法檢驗，方差不齊則采用Dunnett′s法檢驗，P-1腎組織）（P-1，與其餘各組腎汞含量均無明顯差異，遠遠低於氯化汞組。 腎汞含量在 WSHFD0，WSHFD2和 WSHFD3組無顯著差異）。