牛磺酸抑製缺氧誘導大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及信號轉導機製
藥理
作者：張曉丹 孫鵬 朱大嶺 謝楠
[收稿日期] 2013-10-16
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81270113，91339107）；研究生創新基金項目（YJSCX2012-ZZ8HSD）；哈爾濱科技創新人才項目（2013RFXXJ092）；大慶重點項目（SCXZ01011）
[通信作者] *孫鵬，E-mail
[作者簡介] 張曉丹，教授，E-mail
[摘要] 目的：探討牛磺酸（taurine，Tau）對缺氧誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）增殖的影響，並且研究細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）通路是否參與了Tau抑製PASMCs增殖的過程及可能的分子機製。方法：原代培養大鼠PASMCs，選用第2～5代用於實驗。Tau給藥濃度為 80 mmol·L-1，ERK1/2阻斷劑（PD98059）濃度為50 μmol·L-1，給藥時間24 h。①體外噻唑藍比色法（MTT）、細胞免疫熒光和蛋白免疫印記法檢測牛磺酸在不同條件下對大鼠PASMCs增殖能力的影響，將細胞分為4組：常氧組、常氧+Tau組、缺氧組、缺氧+Tau組。②蛋白免疫印記法檢測ERK1/2通路是否參與了Tau抑製缺氧誘導PASMCs增殖的進程中。實驗分為5組：常氧組、缺氧組、缺氧+Tau組、缺氧+Tau+PD98059組、缺氧+PD98059組。結果：①缺氧可誘導PASMCs增殖，常氧情況下Tau對PASMCs細胞增殖無影響，常氧及缺氧條件下Tau對PASMCs中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達無影響。Tau可以逆轉缺氧誘導的細胞增殖核抗原（PCNA）（P[2]。有報道稱Tau可改善糖尿病及心髒病的內質網應激[3]，並能夠抑製主動脈血管平滑肌的增殖，改善主動脈血管的重構[4]，也有研究報道Tau可抑製血管平滑肌的成骨分化[5]，並且該抑製作用是通過ERK1/2通路實現的，揭示Tau可能具有改善肺動脈高壓的功效，從而成為治療肺動脈高壓的新型治療藥物。本實驗主要探討Tau對PASMCs增殖的影響是否通過ERK1/2通路調控從而揭示Tau可能逆轉肺動脈高壓肺血管重構的機製。
1 材料與方法
1.1 材料 Wistar大鼠8～10周齡，180～200 g，購自哈爾濱醫科大學動物實驗中心，合格證號SCXK（黑）2007-0002。牛磺酸購自於楷洋生物技術有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，100 mL，天杭生物）；DMEM培養基（500 mL，賽默飛世爾生物）；兔抗大鼠Cyclin A一抗（20 μL，SANTA公司）；小鼠抗大鼠PCNA一抗（20 μL，SANTA公司）；p-ERK1/2一抗（20 μL，SANTA公司）；TNF-α一抗（100 μL，Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化酶標記的兔二抗、鼠二抗，熒光二抗抗小鼠Cy3（碧雲天公司），ERK1/2阻斷劑PD98059（100 μL，碧雲天公司）。熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；電泳及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）；CO2細胞培養箱（美國 Forma Scientific，Inc，公司）。
1.2 肺動脈血管平滑肌的體外培養 無菌條件下分離大鼠遠端肺動脈，將血管剪成碎塊置於二型膠原酶中消化成絮狀。用20%DMEM高糖培養液終止消化，2 500 r· min-1離心7 min，棄掉上清液，加入細胞培養液混懸後分裝到細胞瓶當中。隔天進行換液，1周後進行鑒定。缺氧培養是置於缺氧培養箱中，溫度37 ℃，5%CO2，3%氧氣。
1.3 MTT比色法測定PASMCs增殖活力 用0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集到一管中混勻。按每孔1萬個細胞接種於96 孔培養板，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育。貼壁後，按照濃度2.5，5，10，20，40，80 mmol·L-1分組加入Tau。培養24 h後，取出96 孔板每孔加MTT溶液（5 g·L-1）20 μL，37 ℃，繼續孵育4 h後，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀上振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀測定490 nm 處吸光度A。
1.4 免疫熒光測PCNA 6孔板中放入蓋玻片，細胞消化後均勻鋪於6孔板的蓋玻片上，細胞生長密度適宜後給藥，細胞給藥時間結束後，PBS衝洗細胞，4%多聚甲醛固定15 min後棄掉，再用PBS衝洗3次，每次5 min。加入0.5% Triton透化穿孔10 min，PBS洗3次，每次5 min。加入3%BSA，37 ℃下封閉30 min。PBS洗後6孔板中每孔加入PCNA一抗4 ℃孵育過夜。第2天回收一抗，PBS洗5 min，一共3次，6孔板中每孔加入100 μL Cy3熒光二抗，避光37 ℃下孵育2 h。時間結束後PBS洗3次，每次5 min。每孔加入100 μL DAPI孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。抗淬滅劑封片，置於熒光顯微鏡下觀察。
1.5 免疫蛋白印跡分析 各組加藥培養24 h後收集細胞，預冷的磷酸鹽緩衝溶液反複衝洗細胞3遍，加入細胞裂解液，冰上裂解15 min後刮取細胞，低溫離心機4 ℃下13 500 r·min-1離心15 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白溶液按4∶1比例加入5×loading buffer，95 ℃煮5 min，8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉印到NC膜上，轉膜結束後，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶400稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，TBST洗膜液洗膜4次，每次10 min，辣根過氧化酶標記的兔二抗、鼠二抗孵育1 h，TBST振蕩洗膜4次，每次10 min。ECL顯色5 min後顯影。曝光後X光片在Quantity One 軟件中進行分析。