在阪本龍馬和中岡慎太郎的反複奔走遊說下，慶應二年正月，長州重臣桂小五郎再次秘密潛入京都，在薩摩藩邸和西鄉隆盛會麵，簽署了共同進退的同盟協議。幕府對此秘密同盟懵然無知，他們隻看到了高杉晉作的“功山寺起義”，看到長州藩的割據傾向，於是決定發動第二次“征長戰爭”。
薩摩藩雖然這次不玩了，但是家茂將軍還是拚湊起了各藩聯軍十五萬之眾，分從山陰、山陽、瀨戶內海和北九州四個方向合圍長藩。幕府先鋒總大將是德川茂承，家茂將軍還親自離開江戶，坐鎮大阪城指揮戰鬥。幕府三萬陸軍從山陰方向走石州口，五萬陸軍從山陽方向走藝州口，兩萬水陸聯軍從長門南方登陸走大島口，另外主力五萬以北九州的小倉城為基地走九州口，目標直指長州重鎮下關和主城萩城。對比幕府的十五萬大軍，長州可戰之兵不過區區四千人而已。如果家茂將軍這次能夠一鼓蕩平長洲藩的話，日本的曆史進程，肯定會被徹底改寫，可惜長洲藩有一個不世出的奇才——大村益次郎。
四境戰爭打了不到兩個月，便因為家茂將軍因腳氣離世，而草草落下了帷幕，無論從哪個角度來說都是以四千克十五萬的長洲藩打贏了。這場戰爭徹底摧毀了幕府的權威，讓將軍的威望一落千丈，長洲藩也正式成為了不受幕府管束的割據雄藩。
長州之所以能夠在“四境戰爭”中取得勝利，原因是多方麵的，最主要在於幕府的腐朽、諸藩聯軍的裝備既差，配合度又不高，而長州則經過軍製改革，裝備精良，同時上下一心，士氣高漲。此外，薩摩以及英國對長州的暗中支持，也起了很大的作用。
當時英、法兩國爭奪對日本的控製權，英國認為幕府已經徹底腐朽，無法利用它來統治整個日本，因此轉而支持藩政開明，並且逐漸打開國門的薩摩、長州等藩，希望實現以天皇為中心的雄藩聯合體製——也就是阪本龍馬所設想的那一套。而法國看到英國這種態度，反倒加強了支持幕府的力度。可以說，如果沒有英國人摻和，長州未必能夠輕鬆打贏“四境戰爭”，而如果法國人不在其中攪事，大概高杉晉作在戰勝後會趁勝追擊，直取京都去也。
隨著第十四代將軍德川家茂和孝明天皇的離世，公武合體最後的一點點希望也泯滅了，倒幕便成了日本最重要的活動。