端粒酶熒光標記法在癌症方麵的應用研究
科技專論
作者：戴鑫禹
【摘要】近幾年，端粒酶的相關研究非常活躍，隨著研究的深入，人們對其結構、性質、功能和性質有了更深的了解，因此對細胞的癌變有了新的認識，即端粒酶的檢測技術對惡心腫瘤的早期診斷及後期監測提供了數據支持，本文通過端粒酶的熒光檢測法對癌細胞的檢測方法進行了研究。
【關鍵詞】端粒酶；癌細胞；腫瘤診斷
1、實驗
1.1培養HeLa細胞
1.1.1培養基的製作：RPMI1640培養基，在加入1%至2%的瓊脂做冷凝劑後，補充培養100U/mL的鏈黴素、青黴素和10%的胎牛血清。
1.1.2細胞的培養：先將這些細胞放在含95%空氣，5%二氧化碳的37攝氏度的氣氛中培養，在細胞的繁殖期，再加入胰蛋白酶之前需要先將泛黃的培養基倒盡，再放入培養箱中大約五分鍾，待其消化完畢，倒出，再加入新的培養基，吹洗兩分鍾後，當觀察到細胞從壁上脫落，並且細胞團被吹散停止，然後用血球計數板計數。
1.2端粒酶的提取及預處理
1.2.1提取端粒酶：第一步，將計數收集到的1.0×106個細胞置於1.5mL的離心管中，在2000轉4攝氏度的條件下離心3分鍾達到去除培養基的作用，再用0.3M的氯化鈉溶液在弱堿性條件下洗滌三次，棄去上清液後，加入0.1mL的裂解液，然後冰浴裂解0.5h（移液槍抽取三次），再在4攝氏度1200轉速下離心20分鍾，取出上清液於離心管中，迅速置於液氮中冷卻，備用。
1.2.2固定DNA探針：在處理好的金電極表麵滴加疏基修飾的寡核咁酸探針的TE-氯化鈉緩衝液，在4攝氏度下組裝，然後將組裝完畢的電極放在弱堿性的氯化鈉溶液中清洗10分鍾，達到除去吸附探針的效果。
1.3熒光性的電化學分析
1.3.1電化學響應：傳感器對端粒酶影響的電化學特征變化為：在端粒酶存在的條件下，T鏈的S沿著3號末端開始擴散增重得到S3長鏈，新增的重複段的序列與雜交區域的堿基是互補的，不能構成穩定的雙鏈，用二價鐵標記的DNA鏈的S2會產生很小的電流峰，隨後加入HeLa滅活細胞的提取物，將被熱破壞的RNA模板用引物鏈來擴增S1，此時，兩個鏈會發生堿基的互補配對，由二茂鐵標記的S2在靠近電機的表麵時發生電子傳遞，由還原峰電流可以看出電子傳遞效應十分高效。同理，我們又引入了探針S4和S5，在端粒酶存在的條件下，得到了TTGAAA堿基長鏈，但與S1不同的是，他仍有8個互補的堿基對，並且通過電分析信號，發現在0.23V處產生了明顯的信號。接下來，我們設計了一組對比試驗（空白試驗），在其與條件相同的情況下，加入了端粒酶的失活物，結果在傳感器譜圖立刻出現了一個峰，與標準譜圖比較後發現，這是一個典型的二茂鐵還原峰。綜上，我們可以得出這樣一個結論，在端粒酶存在的情況下，由二茂鐵標記的S2 DNA鏈上的Fc從電極表麵釋放下來。
1.3.2熒光活性的檢測：將HeLa細胞裂解後，提取10微升的DNA修飾液，調節pH至8.2，再計入1.5微升飽和氯化鎂和氯化鉀溶液，32攝氏度恒溫箱中放置2h，然後使用熒光分光光度計進行熒光強度的檢測。
1.3.3延伸性的電化學檢測：將60微升的裂解後的端粒酶擴增液等分成十份，每份加入10微升的EDTA，同樣置於32攝氏度的恒溫箱2h，需要注意的是裂解液是NB-47裂解液在90攝氏度水中滅火0.5h後加入等體積鹽酸後的溶液。將電極插入由3毫升NB-47和12毫升DPR混合液中，再進行電化學檢測。