百蕊草的吸器誘導及發育信號物質的分離鑒定
資源與鑒定
作者：劉波 張曉明 郭巧生 王長林 陳璐 宋玲珊 安開龍
[摘要] 利用GC-MS檢測鑒定百蕊草優勢寄主植物夏枯草根係分泌物，並對2，6-二甲氧基-對苯醌（DMBQ）對百蕊草吸器誘導作用進行了初步研究。通過分析鑒定得到了9類53種化合物，其中大多數為烴類化合物、酯類化合物和有機酸類化合物，而酚酸類、醛類和醌類化合物種類則較少，分別隻檢測出1種。其中2，5-二叔丁基-1，4-苯醌具有1，4-對苯醌核心結構，可能對夏枯草與百蕊草寄生關係的建立具有重要意義。DMBQ能夠誘導百蕊草根係產生吸器，並且1 μmol·L-1DMBQ對百蕊草吸器的誘導能力最強。
[關鍵詞] 百蕊草；吸器；氣質聯用；信號物質
[收稿日期] 2014-06-09
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81173482）
[通信作者] *郭巧生，Tel：（025）84395980，E-mail
百蕊草Thesium Chinense Turcz.為檀香科百蕊草屬多年生半寄生藥用植物[1]，在我國東部省區分布範圍較廣，日本和朝鮮也有分布。《中國藥典》（1977年）、《中藥大辭典》（1977年）、《新華本草綱要》（1988年）和《中華本草》（1999年）等多部藥學典籍均有收載，具有清熱解毒、補腎澀精、解暑利濕作用。現代研究表明百蕊草具有顯著抗炎、鎮痛和廣譜抗菌作用[2-4]，被譽為“植物抗生素”。目前，百蕊草主要以野生資源供應市場需求，隨著需求量的日益增加，人工栽培勢在必行。但其栽培生理基礎研究非常薄弱，極大限製了百蕊草的人工栽培。
作為兼性半寄生植物，百蕊草寄主植物種類廣泛，生長在其周圍的草本或木本植物大都可被其寄生[5-7]。夏枯草Prunella vulgaris不僅是常見的藥用植物，也是百蕊草最為普遍的寄主植物之一[8]。吸器是寄生植物的特殊器官，是寄生植物從寄主吸取營養物質的通道，寄主植物釋放的次生代謝產物作為化學信號物質，在寄生關係的建立過程中起著關鍵作用[9-10]。研究表明，2，6-二甲氧基-對苯醌（DMBQ）是最為普遍有效的寄生植物吸器發生信號物質，其核心結構是1，4-對苯醌[11-12]。因此，本實驗在前人研究的基礎上，利用GC-MS鑒定百蕊草優勢寄主植物夏枯草根係分泌物，並用DMBQ對百蕊草幼苗進行處理，觀察其對吸器的誘導情況，旨在為從根本上探討和解決百蕊草人工栽培的關鍵問題提供理論參考。
1 材料
1.1 植物
夏枯草種子采集於江蘇南京，百蕊草種子采集於江蘇鎮江，經南京農業大學郭巧生教授鑒定為夏枯草P. vulgaris及百蕊草T. Chinense的成熟種子。
1.2 試劑和儀器
RE-52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），HP6890GC/5973MSD 氣相色譜-質譜聯用儀（Hewlett Packard 公司），人工氣候箱（浙江托普儀器有限公司），SZX7體式顯微鏡（OLYMPUS），DMBQ，Amberlite XAD-4吸附樹脂（Sigma-Aldrich），GA3，HCl，甲醇均為國產分析純。
2 方法
2.1 百蕊草吸器發育信號物質的分離鑒定
2.1.1 寄主植物的培養及根係分泌物的收集 將采集的夏枯草種子用蒸餾水衝洗幹淨，浸泡24 h，種植於石英砂上（石英砂粒徑約1 mm，用2 mol·L-1的HCl浸泡24 h後，再用蒸餾水衝洗至中性，110 ℃高溫滅菌3 h後，置於循環收集裝置容器中），培養期間定期用Hoagland營養液澆灌。待夏枯草根係布滿整個循環收集裝置，將XAD-4吸附樹脂柱接入裝置，循環收集7 d，用5倍柱體積甲醇洗脫。洗脫液45 ℃恒溫濃縮至幹。濃縮物加入甲醇溶解後，取濾液進行GC-MS分析測試。按同樣方法收集無夏枯草的石英砂洗脫液為對照。
2.1.2 GC-MS分析 將收集的夏枯草根係分泌物於HP6890/5973MSD 氣相色譜-質譜聯用儀進行測定。測定采用DB-5石英毛細管色譜柱（0.25 mm×30 m， 0.25 μm），進樣口溫度280 ℃，按程序升溫，初始溫度為50 ℃，以10 ℃·min-1的升溫速率升至290 ℃；維持10 min。載氣為高純氦氣，流量1.0 mL·min-1；進樣量1 μL；分流比20∶1。EI 電離源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃，掃描質量m/z 35～500全掃描。
2.2 DMBQ對百蕊草吸器誘導的影響
2.2.1 百蕊草種子預處理 將采集到的百蕊草種子自然風幹，去除雜質和空癟種子後，選留成熟飽滿的種子用流水衝洗24 h，再用500 mg·L-1的GA3水溶液浸種泡24 h，撈出後晾幹種子表麵水分。將處理後的百蕊草種子與河沙按1∶3混合均勻，基質含水量以“手握成團，鬆手即散”為宜，置於4 ℃冰箱中層積處理150 d以打破種子休眠。
2.2.2 DMBQ誘導百蕊草吸器形成 百蕊草種子打破休眠萌發後，用蒸餾水衝洗幹淨，種於穴盤中，栽培基質為石英砂。將穴盤放置於人工氣候箱中進行培養（培養溫度25 ℃，12 h·d-1晝夜變化，30～40 μmol·m-2·s-1的光照強度）。待百蕊草小苗生長至5 cm高左右，配施5個濃度梯度DMBQ水溶液（1 000，100，10，1，0.1 μmol·L-1）處理百蕊草幼苗根係，以蒸餾水處理為對照，每個處理均做30個重複（30株幼苗）。培養20 d，挖出百蕊草根係，衝洗幹淨根係表麵的石英砂，置於體式顯微鏡下，觀察吸器的發生情況，並統計吸器的發生數目，同時稱量各根係的質量。