2.2 動物分組 共分為5組：模型對照組、環磷酰胺組（CTX，80 mg·kg-1）、環磷酰胺+熊膽粉高劑量組（CTX+HB，300 mg·kg-1）、環磷酰胺+熊膽粉中劑量組（CTX+MB，150 mg·kg-1）、環磷酰胺+熊膽粉低劑量組（CTX+LB，75 mg·kg-1）。於接種手術完成後第2天開始每天口服灌胃中西藥混合液，模型組灌服等量生理鹽水。
2.3 造模 按照本實驗室改良的脾髒原位造模方法[2]接種SL4結直腸癌細胞，製作肝轉移模型。60隻動物全部實施接種手術，第2天開始連續灌胃給藥，每日密切觀察，隔天稱1次體重，於接種後第13天處死小鼠。
2.4 動物稱重、取材以及肝脾髒器大體觀察 接種SL4細胞後第13天，所有小鼠稱體重，采用摘除眼球法取血，以肝素抗凝（終濃度20 U·mL-1），混勻後室溫放置，統一進行熒光染色；解剖肝脾組織，觀察腫瘤生長及轉移情況，測量腫瘤大小並稱量肝脾質量；取部分脾髒組織和肝脾腫瘤製備單細胞懸液，4 ℃保存。
2.5 組織病理學觀察 將剩餘肝脾組織置於10%甲醛溶液中固定，製作石蠟切片，進行HE及免疫熒光染色，顯微鏡下觀察病理學改變。
2.6 小鼠外周血、脾髒組織和肝髒轉移腫瘤組織免疫細胞分析 外周血用紅細胞裂解液（FACS lysing solution）裂解紅細胞，脾髒組織和肝髒轉移瘤組織經剪碎研磨，製成單細胞懸液，然後分別進行熒光抗體染色。每隻動物每個組織2管，每管分別加入如下抗體：①CD3e，FITC/NK1.1，PE/CD45，PerCP，Cy5.5/CD4，PE，Cy7/CD45R/B220，APC/ CD8a，APC，Cy7；②CD11c，FITC/F4/80，PE/CD45，PerCP，Cy5.5/Ly6A/E，PE，Cy7/Ly6C，APC/ CD11b，APC，Cy7；然後加入100 μL各組織樣本，充分混勻，室溫避光染色30 min；PBS洗滌後，以1%多聚甲醛固定，流式細胞儀分析免疫細胞表型變化。
2.7 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件進行處理，實驗數據以±s表示，各組樣本均數比較采用單因素方差分析，以P由此提高了CD3+CD4+/CD3+CD8+比值，增加了機體免疫力；B細胞與模型組比下降明顯（P[4]。出於對國家二級動物“黑熊”的保護，沈陽藥科大學成功研製了“人工熊膽”，其化學組成、理化性質、穩定性等均與天然熊膽一致，為拓展研究熊膽粉的功用提供了條件。現代藥理學研究證明，熊膽粉具有保肝利膽、抗炎抑瘤、提高機體免疫力等作用[5，7]，本研究同樣證實了此結果，研究表明，熊膽粉不僅具有保肝增免作用，還具有抗腫瘤轉移以及調控腫瘤微環境作用。
腫瘤微環境是近年來國內外癌症研究中，廣泛關注的一個新的治療靶點和研究方向[8]。主要由腫瘤細胞本身和腫瘤局部所浸潤的免疫炎症細胞、間質細胞及其分泌的活性介質等組成，它們共同參與腫瘤的發生、發展和轉移[9]，其中免疫炎症細胞起關鍵性作用，主要是腫瘤浸潤性白細胞，包括淋巴細胞和髓係細胞（中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等）。研究表明，來自血液的腫瘤浸潤炎性細胞具有調節腫瘤微環境的作用，破壞免疫係統對腫瘤細胞的免疫監視功能，通過分泌細胞因子和細胞間的相互作用促進腫瘤血管新生，改變腫瘤細胞對激素以及抗腫瘤藥物的反應，促進惡性細胞的增殖和轉移[10，11]。因此，調控腫瘤微環境中浸潤性炎症細胞，降低其表達或分泌，對抑製腫瘤轉移意義重大。本研究應用熊膽粉聯合CTX治療CRC肝轉移模型小鼠，以流式細胞術分析外周血、脾髒以及肝轉移腫瘤中炎症細胞浸潤狀況，結果表明，低劑量熊膽粉（75 mg·kg-1）與CTX聯合用藥組降低炎症細胞浸潤作用最為明顯，肝轉移組織中CD11c細胞由51.7%降至22.5%（P-1） treatment group， the CTX+BBP high dose （300 mg·kg-1） group， the CTX+BBP middle dose （150 mg·kg-1） group and the CTX+BBP low dose （75 mg·kg-1） group. Mice were orally administered with drugs for 12 days， and sacrificed on the 13th day for weighing their spleens and lives， HE staining， and immunofluorescence analysis. Their peripheral blood， and metastatic tumor in spleens and lives were analyzed with flow cytometry. Result： Spleen and liver weights of the CTX treatment group and other doses groups were significantly lower than that of the model group. HE staining and immunofluorescence analysis showed that lymphocyte infiltration was detected in normal tissues， and macrophages infiltration was observed around the tumor tissues. Flow cytometry analysis showed that the number of T，lymphocytes in peripheral blood of different doses groups were much higher than that of the CTX treatment group （P