熊膽粉聯合環磷酰胺用藥通過調控腫瘤微環境抑製結直腸癌肝轉移作用的研究
藥理
作者：崔巍 劉颯 楊敏 張婷 蔡倫 邱淑蘭 鄭嬌 苗豔菊 趙莉敏 杜傑
[摘要] 目的：探討熊膽粉聯合環磷酰胺（cyclophosphamide， cytoxan， CTX）用藥通過調節腫瘤炎症微環境對小鼠結直腸癌（colorectal carcinoma， CRC）肝轉移模型的增免抑瘤抗轉移作用。
方法：脾髒原位注射SL4細胞製作小鼠CRC肝轉移模型。隨機分5組：模型組、CTX組（80 mg·kg-1）和CTX聯合熊膽粉高、中、低劑量組（300，150，75 mg·kg-1）。術後口服灌胃給藥12 d，於第13天取材，解剖肝脾稱重，HE染色，免疫熒光分析；外周血、脾和肝轉移瘤進行流式細胞免疫表型分析。
結果：CTX組及CTX聯合熊膽粉各組肝脾質量明顯低於模型組（P4/CD8增加；脾細胞懸液中，聯合治療組與CTX組比較，淋巴細胞總數增加，以B細胞增加較為顯著（P[1]，臨床放化療效果不明顯，成為CRC治療瓶頸。本研究應用保肝良藥熊膽粉（bear bile powder）聯合化療藥環磷酰胺（cyclophosphamide， cytoxan， CTX）治療CRC肝轉移模型[2]小鼠，探求以中西醫結合治療的方法，通過調控腫瘤微環境尋找幹預靶點，增免抑瘤抗轉移，延長生存期。
1 材料
1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠60隻，6～8周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
1.2 細胞係 小鼠CRC肝轉移細胞係SL4，由中國科學院基因所劉斯奇教授惠贈。
1.3 藥物 複方環磷酰胺片（天津金世製藥有限公司，批號）；熊膽粉（福建歸真堂藥業股份有限公司，批號），由北京中醫藥大學東方醫院李軍祥教授提供。
1.4 試劑與儀器 DMEM/F12培養基、胎牛血清等購自美國Hyclone公司；CD45，PerCP，Cy5.5，CD3e，FITC，CD4，PE，Cy7，CD8a，APC，Cy7，NK1.1，PE，CD45R/B220，APC，CD11c，FITC，CD11b，APC，Cy7，Ly，6C，APC，Ly6A/E，PE，Cy7及同型對照均購自美國BD Pharmingen公司；F4/80，PE購自美國eBioscience公司；FACS Lysing Solution紅細胞裂解液購自美國BD Pharmingen公司。CM1950石蠟切片機（德國LEICA公司）；ECLIPSE 90i顯微鏡和NIS，Elements F3.0分析軟件（日本Nikon公司）；LSRFortessa流式細胞儀（美國BD公司）。
2 方法
2.1 SL4細胞係體外培養 將液氮保存的SL4細胞取出，迅速放入37 ℃水浴中解凍，1 000 r·min-1離心5 min，PBS重懸，洗滌後，置37 ℃，5%CO2培養箱，以10%胎牛血清的DMEM/F12培養基孵育培養，經換液傳代至對數生長期，調整細胞到1×107個/mL，用於小鼠體內實驗接種，接種時每隻小鼠注射100 μL。