丹參總酚酸及三七總皂苷配伍對缺氧複氧損傷心肌細胞的保護作用研究
藥理
作者：龔婉 肖揚 張萌 王毅 王怡
[摘要] 目的：探索丹參總酚酸及三七總皂苷配伍對心肌細胞缺氧複氧（hypoxia，reoxygenation， HR）損傷的保護作用機製。
方法：采用缺氧複氧損傷H9c2細胞模型，MTT法測定丹參總酚酸、三七總皂苷配伍對細胞活力的影響，並測定細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）漏出率，評價丹參總酚酸、三七總皂苷配伍對心肌細胞的保護作用；采用Hoechst33342熒光染色觀察細胞凋亡，並用流式細胞術檢測不同藥物幹預後心肌細胞凋亡率；采用Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bcl，2，Bax，Caspase，3的表達情況；定磷法檢測細胞內Na+〖KG-*3〗，K+，ATPase，Ca2+，Mg2+，ATPase的變化，化學發光法檢測細胞內ATP含量的變化。
結果：丹參總酚酸、三七總皂苷分別在0.05～0.5，5～50 mg·L-1配伍時對缺氧複氧損傷的心肌細胞具有濃度依賴性的協同保護作用；丹參總酚酸與三七總皂苷均能減輕缺氧複氧導致的心肌細胞的凋亡並且改善心肌細胞的能量代謝，配伍後作用更為明顯。
結論：丹參總酚酸、三七總皂苷配伍具有協同增效作用，可通過抑製細胞凋亡和改善能量代謝對抗缺氧複氧對心肌細胞的損傷。
[關鍵詞]丹參總酚酸；三七總皂苷；H9c2；配伍；凋亡；能量代謝
複方丹參方是臨床確有療效的中藥驗方，其製劑在心絞痛、無症狀心肌缺血、冠心病等心血管疾病的預防與治療上效果顯著[1]。現代藥理學研究表明，丹參對血管的效應強於三七，三七對缺氧心肌保護作用強於丹參，二者配伍後存在協同互補效應[2]。本課題組在前期研究工作中采用犬結紮冠脈左前降支造成急性心肌缺血模型，研究發現丹參、三七不同比例配伍在降低心肌耗氧量、改善心肌缺血，抗心律失常，調節微循環等方麵呈現不同的作用，各自存在著最佳配伍比例[3，6]。還研究了丹酚酸B和丹參酮ⅡA不同配比對缺氧損傷心髒微血管內皮細胞的影響，表明兩者配伍優於單一藥物[7，8]。
丹參總酚酸是丹參的主要水溶性成分，三七總皂苷是三七的主要活性成分。有報道表明，丹參總酚酸與三七總皂苷按一定比例配伍，可使麻醉犬心肌氧攝取率顯著下降，存在協同增效作用[9]，然而二者配伍的心肌保護作用機製尚不明確。本研究采用缺氧複氧損傷心肌細胞模型，從抗細胞凋亡以及調節能量代謝2個方麵探討丹參總酚酸、三七總皂苷及其配伍對心肌細胞的保護作用機製。
1 材料
1.1 細胞株 H9c2 大鼠心肌細胞株，購於武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 藥物與試劑 丹參總酚酸（TSA）由本實驗室製備，三七總皂苷（PNS）由黑龍江珍寶島藥業股份有限公司提供，純度均高於90%；高糖DMEM培養基，無糖DMEM培養基，胎牛血清，胰蛋白酶（美國Gibco公司）。MTT，二甲基亞碸（DMSO），Hoechst33342（美國Sigma公司）。FITC，Annexin V/PI試劑盒（美國Calbiochem公司，批號D）。乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒，超微量ATP酶測試盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為，）。ATP檢測試劑盒（碧雲天生物技術研究所，編號S0026）。Bax，Caspase，3抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；Bcl，2抗體（美國Santa Cruze公司）；Tublin抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，苯甲基磺酰氟（PMSF），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧雲天生物技術研究所）。RIPA裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）。ECL顯色液（Milipore公司）。
1.3 儀器 Bio，Tek ELX800酶標儀（美國Bio，Tek公司）；Infinite 200多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；熒光顯微鏡（日本Olymbus公司）；BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；缺氧小室，二氧化碳培養箱，超淨工作台（美國Thermo公司）；DYY，6C電泳儀（北京六一儀器廠）；iBlot轉膜儀（美國Invitrogen公司）。
2 方法
2.1 缺氧複氧模型的製備 H9c2細胞於二氧化碳培養箱常規培養後接種至不同培養板中，用含10%FBS的DMEM培養基培養，貼壁生長24 h後棄去培養基，PBS洗2遍，換成用混合氣（95%CO2+5%N2）預飽和過的無糖 DMEM 培養基（不含FBS），同時將細胞轉移至缺氧小室中，持續通入混合氣（95%CO2+5%N2）10 min，夾緊進氣管和出氣管，置於二氧化碳培養箱中培養12 h，此過程為缺氧。缺氧完畢後，換成完全培養液（高糖DMEM+10%FBS），置於二氧化碳培養箱中培養6 h。此過程為複氧。
2.2 分組與給藥 將H9c2細胞分成6組，分別為：正常對照組 （control）、模型組 （model） 、丹參總酚酸組（0.5 mg·L-1）、三七總皂苷組（50 mg·L-1）、配伍低劑量組（丹參總酚酸0.25 mg·L-1+三七總皂苷25 mg·L-1）、配伍高劑量組（丹參總酚酸0.5 mg·L-1+三七總皂苷50 mg·L-1）。給藥組按模型組方法處理，在缺氧複氧的同時給予不同的藥物幹預。對照組細胞繼續用含10%FBS的高糖DMEM，置於二氧化碳培養箱培養。
2.3 心肌細胞活力的測定 將細胞種於96孔板中，經缺氧複氧及不同濃度的丹參總酚酸（0.05，0.10，0.25，0.5 mg·L-1）和三七總皂苷（5，10，25，50 mg·L-1）配伍幹預後，吸去培養基並洗滌，再加入含0.5 g·L-1 MTT的培養液，培養箱內繼續孵育4 h。棄去上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀於550 nm處檢測定吸光度。按公式計算細胞存活相對保護率= （A處理組-A模型組）/（A正常組-A模型組）。並依據Chou，Talalay中效原理，以CalcuSyn藥效學分析軟件計算協同作用指數（CI），評價聯合作用效應（CI為相加作用；CI>1時，為拮抗作用）[10]。
2.4 LDH漏出率的測定 將細胞種於48孔板中，經缺氧複氧及不同濃度的丹參總酚酸（0.05，0.10，0.25，0.5 mg·L-1）和三七總皂苷（5，10，25，50 mg·L-1）配伍幹預後，吸取每孔內的細胞培養上清液，按LDH試劑盒說明書操作，比色法檢測細胞上清中LDH的活力。按公式計算細胞LDH釋放相對抑製率= （LDH模型組-LDH處理組）/（LDH模型組-LDH正常組）。並以CalcuSyn藥效學分析軟件計算協同作用指數（CI）。