半夏毒針晶的致炎效應與巨噬細胞的相關性研究
藥理
作者：趙騰斐 張倩 張雯 吳皓 鬱紅禮 王慧珠
目的：研究半夏毒針晶刺激性毒性產生的機製。
方法：采用小鼠腹腔巨噬細胞體外培養模型，以培養上清液中TNF，α，IL，1β和IL，6為指標，研究半夏毒針晶致炎的量，毒，時，毒曲線；采用掃描電鏡法觀察經半夏毒針晶刺激後巨噬細胞表麵形態學的改變；使用巨噬細胞，中性粒細胞共培養遷移模型，考察半夏毒針晶刺激巨噬細胞對中性粒細胞遷移的影響。
結果：半夏毒針晶刺激巨噬細胞，可引起TNF，α，IL，1β和IL，6含量顯著升高，且具有劑量和時間依賴性；掃描電鏡顯示，半夏毒針晶可被巨噬細胞吞噬，細胞膜表麵皺褶明顯，偽足數量增多，細胞膜完整性下降，並能顯著誘導中性粒細胞遷移。
結論：巨噬細胞在毒針晶的致炎過程中起關鍵的介導作用。半夏毒針晶的毒性機製是毒針晶刺入組織，激活組織中的駐留巨噬細胞，引起吞噬、促炎細胞因子釋放、中性粒細胞大量遷移，最終導致強烈的急性炎症反應。
[關鍵詞]半夏毒針晶；巨噬細胞；炎症因子；掃描電鏡；中性粒細胞趨化
半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata （Thunb.） Breit.的幹燥塊莖。因其味辛辣、麻舌而刺喉，具有“戟人咽”的刺激性，被列為有毒中藥[1，2]。本課題組前期研究表明半夏刺激性毒性成分為其含有的特殊晶型的毒針晶。半夏毒針晶可以引起黏膜或組織嚴重的急性炎症反應，可引起家兔眼結膜強烈水腫；小鼠腹腔炎症滲出液中NO，MDA顯著增加；大鼠足蹠腫脹，PGE2含量顯著升高[3，5]，故半夏毒針晶具有顯著的炎症刺激性毒性。課題組前期試驗研究顯示，毒針晶的刺激性毒性與其刺激巨噬細胞相關[6，7]。故本文采用小鼠腹腔巨噬細胞（MΦ）體外培養模型及體外中性粒細胞遷移模型，深入研究半夏毒針晶刺激巨噬細胞與其誘發炎症的相關性，為進一步揭示半夏及天南星科其他有毒中藥的毒性機製提供依據。
1 材料
1.1 藥品與試劑 半夏鮮品，采自江蘇省泰州高港半夏GAP基地，經南京中醫藥大學王春根教授鑒定為天南星科植物半夏P. ternata的塊莖。鮮半夏塊莖切碎，加入少量有機試劑，將數次研磨提取的混懸液合並，先用4層醫用紗布過濾，濾液再經過微孔濾膜過濾，得到白色濾餅，將白色濾餅刮下，即為提取的毒針晶。毒針晶主要由草酸鈣和蛋白組成[8]。
RPMI1640培養液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；transwell小室，48孔培養板（美國Corning公司）；Percoll分離液，Dextran，T500（葡聚糖）（美國Pharmacia公司）；快速瑞姬氏染液（南京建成生物工程研究所）；TNF，α，IL，1β和IL，6 ELISA試劑盒（美國Ebioscience公司）；戊二醛（電鏡級，美國Alfa公司），其他試劑均為分析純。
1.2 動物 ICR小鼠，清潔級，雄性，體重25～27 g，由南京醫科大學動物中心提供，許可證號SCXK（蘇）2008，0004。
1.3 儀器 BP211D電子天平（德國 Sartorius 公司）；LDZ，2（Y） 低速離心機（北京京立有限公司）；Spectra Max 190 酶標儀（美國AD公司）；二氧化碳培養箱（美國NUAIRE公司）；LEICA MPS 60 DM顯微鏡係統（德國萊卡公司）；日立IB，5離子濺射儀；菲利蒲SEM，505掃描電子顯微鏡。
2 方法
2.1 細胞的分離與純化 小鼠腹腔巨噬細胞：健康小鼠以脫頸椎的方法處死，75%乙醇完全浸泡，腹腔注射D，Hanks緩衝液，輕柔地充分按摩腹部，將收集到的腹腔液於1 500 r·min-1離心10 min，沉澱即為富含巨噬細胞的細胞層。棄去上清，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養液重懸沉澱並調節細胞密度至1×106個/mL，以此密度將細胞接種在48孔板中，37 ℃，5%CO2培養2 h後，用D，Hanks緩衝液洗去未貼壁的細胞，繼續培養，未被洗去的貼壁細胞即為純化得到的巨噬細胞。台盼藍染色鑒定細胞存活率為99%；非特異性酯酶染色鑒定巨噬細胞純度為98%。
人外周血中性粒細胞[9]：無菌采集健康誌願者的外周靜脈血，在血液中加入6%的Dextran，T500充分沉澱紅細胞，上清液於1 500 r·min-1離心10 min，棄去上清，沉澱用RPMI1640培養液1 mL重懸。100%的Percoll細胞分離液用生理鹽水分別配成75%，60% 2種不同密度的分離液，在離心管中依次小心加入75%，60%Percoll和細胞懸液，於2 500 r·min-1離心20 min，收集2層分離液中間的細胞層，並用D，Hanks緩衝液清洗2遍，即得到純化的中性粒細胞。台盼藍染色鑒定細胞存活率為99%；快速瑞姬氏染色鑒定中性粒細胞純度為97%。
2.2 半夏毒針晶對巨噬細胞釋放促炎細胞因子的作用 量，毒關係考察：巨噬細胞依照上述方法純化培養，在實驗前用D，Hanks緩衝液清洗，並加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。取適量半夏毒針晶於紫外燈下充分照射滅菌，用 D，Hanks緩衝液分別配成不同濃度的混懸液。培養的巨噬細胞分成6組，每組設置3個複孔，其中5組分別給予相同體積的不同濃度的半夏毒針晶混懸液，使終濃度分別為5，10，20，50，100 mg·L-1；空白組給予相同體積的D，Hanks緩衝液，搖晃均勻後於37 ℃，5%CO2孵育。3 h後取出細胞上清液，上清液中TNF，α，IL，1β和IL，6的水平按照ELISA試劑盒說明書的方法檢測。
時，毒關係考察：巨噬細胞和半夏毒針晶的處理方法如上所述。半夏毒針晶用D，Hanks緩衝液溶液配製成混懸液。培養的巨噬細胞分為18組，每組設置3個複孔。其中9組分別給予相同體積的半夏毒針晶混懸液，使終濃度均為50 mg·L-1；對應的9個空白組給予相同體積的D，Hanks緩衝液，搖晃均勻後於37 ℃，5%CO2孵育。分別於孵育後0.5，1，1.5，2，2.5，3，6，9，12 h收集相應時間點組別的細胞上清液，上清液中TNF，α，IL，1β和IL，6的水平按照ELISA試劑盒說明書的方法檢測。
2.3 半夏毒針晶對巨噬細胞表麵形態學的影響 小鼠腹腔巨噬細胞經過純化，以1×106個/mL接種，爬片於內置無菌蓋玻片的6孔細胞培養板內。半夏毒針晶經過紫外照射滅菌，用D，Hanks緩衝液配製成混懸液。培養的巨噬細胞分為4組，每組設置3個複孔。其中2個模型組中加入等體積的半夏毒針晶混懸液，使終濃度均為50 mg·L-1；對應的空白組給予等體積的D，Hanks緩衝液，放置於37 ℃，5%CO2環境中培養。分別於0.5，3 h後中止培養，棄去細胞上清液，用D，Hanks緩衝液清洗細胞，最後用2.5%戊二醛固定過夜。載有固定好的巨噬細胞的蓋玻片通過乙醇逐級脫水（乙醇質量分數依次為30%，50%，70%，80%，90%，100%），噴金，掃描電鏡下以5 000倍放大觀察巨噬細胞形態變化，並拍攝照片。