不同製片方法對乳腺疾病DNA倍體分析的影響
技術與方法
作者：董原 倪桂寶
[摘要] 目的 摸索三種不同製片方法對乳腺疾病石蠟組織細胞的DNA進行定量分析，探討三種方法的優劣及其在細胞DNA定量分析過程中的影響。 方法 本實驗采用常規製片脫蠟法、常規製片脫蠟酶消法、石蠟組織製備細胞懸液法，分別對80例乳腺疾病的石蠟組織進行Feulgen染色，應用全自動DNA倍體分析儀對DNA染色玻片進行掃描分析。 結果 在三種方法中，常規製片脫蠟法染色結果不理想，常規製片脫蠟酶消法取得了最佳的染色效果，而石蠟組織製備細胞懸液法製備的玻片上部分區域存在一定的細胞重疊現象。 結論 常規製片脫蠟酶消法可用於乳腺疾病石蠟切片的DNA倍體分析。
[關鍵詞] DNA倍體分析；乳腺疾病；製片方法
[中圖分類號] R44 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0053-03
乳腺癌是危害婦女健康的最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌前病變尤其是非典型性增生與乳腺癌關係相當密切，以組織細胞學形態為主要根據判斷乳腺癌前病變與乳腺原位癌有時相當困難[1-3]。DNA異倍體的形成是一個多因素相互作用的結果，已有很多報道表明，DNA倍體與臨床分期、增殖和預後有關。DNA倍體檢測與分析的技術方法目前在細胞學領域應用廣泛[4-6]，但在乳腺疾病實體組織中的應用國內未見報道。本研究使用三種製片方法對乳腺疾病的石蠟組織進行細胞DNA定量分析，旨在摸索出一種穩定有效的實體組織DNA倍體分析製片方法，為乳腺疾病DNA倍體分析檢測提供前提和必要條件。本文將三種製片方法及其質量等作一比較分析。
1 材料與方法
1.1 材料
收集我院2012年10～12月送檢乳腺疾病實體組織蠟塊並進行篩選分組，分組如下：乳腺增生症20例，乳腺非典型增生疾病20例，乳腺原位癌20例，乳腺浸潤性癌蠟塊20例。每例病例選取最具代表性的蠟塊各一塊，共80塊蠟塊。
1.2 製片
分三組對80個蠟塊進行DNA倍體分析前製片工作。
1.2.1 A組（常規製片脫蠟法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行2μm厚切片1張。石蠟切片於56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟10min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗後進行。
1.2.2 B組（常規製片脫蠟酶消法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行2μm厚切片1張。石蠟切片於56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗，蒸餾水中高壓修複2 min 30 s，37℃胃蛋白酶消化5min，PBS清洗。
1.2.3 C組（石蠟組織製備細胞懸液法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行5 μm厚切片10張。經56℃二甲苯脫蠟20 min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，加入3 mL膠原酶消化液，置37℃恒溫水浴鍋中消化30 min並不斷用吸管吹打，1 000轉/5 min離心沉澱，收集細胞懸液，低滲液低滲15 min，1 000轉/5 min離心沉澱，PBS液漂洗2次，1 000轉/5 min離心沉澱。80例均製備細胞懸液塗片，鏡下觀察確保保留完整的細胞核。
1.3 染色
將A、B、C三組玻片置B.S 固定液中固定50 min；流水洗滌1 min；5N鹽酸酸解1 h，室溫 （25±2）℃；流水洗滌1 min；將切片置Feulgen染液中染色75 min，室溫（25± 2）℃[2]；流水洗滌1 min後，蒸餾水中浸洗15 min[7]。
1.4 脫水
玻片置於75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min。
1.5 封片
將玻片依次置於無水乙醇： 二甲苯（1：1）、100% 二甲苯、100%二甲苯中3 min；再一張張取出，滴加中性樹膠進行封片。
1.6 細胞DNA定量分析
三組所有玻片經Feulgen 染色後采用Motic BA600全自動高分辨率細胞DNA圖像定量分析係統（全自動DNA倍體分析儀）進行掃描分析。係統硬件由全自動數碼顯微鏡Motic600及攝像頭205C組成，對每個標本的單張玻片中約8 000個細胞核進行掃描測定，以標本單張玻片中的正常細胞作為內參，同時進行100多個參數的特征值的處理分析，並根據其不同數值自動完成細胞計數和分類。其中表示DNA含量的DNA指數（DNA Index，DI）為關鍵參數， DI值的計算方法為：被測細胞的積分光密度（IOD）與正常細胞積分光密度的比值。正常上皮細胞DI 值範圍在（1±0.25）之間；當1.25
使用ICLASSY軟件進行圖像分析，觀察A、B、C三組玻片中各個樣本的細胞成像情況、IOD值、MEAN值等指標。被測細胞的積分光密度（IOD）[9]和平均峰值是判定該實驗結果的重要參數，前者決定每個細胞最後的DI值，後者決定標本是否存在標準化偏差。
2 結果
2.1 A組（常規製片脫蠟法）
掃描玻片中細胞數量均達8 000個，鏡下細胞核基本為平層，細胞核完整、少見破裂現象，玻片中有紅細胞、炎細胞存在。部分細胞染色較深，部分細胞染色較淺，IOD值均偏大，在145～165之間，不符合最佳染色深度觀察指標。平均峰值均在1.3以上，不符合最佳染色標準。