1832年2月28日，“貝格爾號”艦駛抵巴西。達爾文登上南美洲大陸和附近的島嶼進行考察。他的足跡遍及巴西熱帶雨林、裏約熱內盧、馬爾多納多、薩爾瓦多、布宜諾斯艾利斯、火地島、智利和秘魯等地，曆時三年半。
他爬高山、涉溪水、入叢林，過草原，搜集珍奇的動植物標本，挖掘古生物化石，曆盡千辛萬苦。他經常和同伴騎著馬在荒無人煙的地帶進行考察，並虛心地向當地居民請教。日曬雨淋，饑渴勞累，以及毒蛇猛獸和傳染病的威脅，都沒有使他畏縮不前。
達爾文的思想隨著考察的進展而不斷地向前發展。他開始認真思考“秘密中的秘密——新的生物在世界上初次出現的問題”。究竟是維護“物種不變”和“上帝創造萬物”的傳統觀念，還是尊重客觀事實，即物種在隨著氣候、環境的逐漸變化而不斷地發生變異？在達爾文頭腦中展開了激烈的思想鬥爭。
1835年秋天，“貝格爾號”艦抵達拉帕戈斯群島，在這裏，達爾文采集到26個類型的陸棲鳥類。不久，航行到塔希提島和新西蘭，又經過澳大利亞橫渡印度洋，再繞過好望角，回到了大西洋。1836年10月，“貝格爾號”
艦凱旋回國。達爾文回到希魯茲伯裏同闊別5年的家人團聚了。這次航行，決定了達爾文一生的事業。
達爾文回國後不久，經過亨斯洛教授介紹結識了著名的地質學家賴爾。
他接受賴爾教授的建議，先在劍橋把考察中收集到的標本整理好，然後就搬到倫敦，在大英博物館附近租了房間住下，用了兩年時間核對了航海日記中的全部記錄，聯係出版了《貝格爾艦航行中的動物學》，還發表了幾篇地質學論文。隨後，他便把主要精力投入到探索物種起源和生物進化問題上來。
這一期間，達爾文的腦海中經常盤旋著這樣的事實，比如，在巴塔哥尼亞發現的動物化石，年代雖然久遠，卻和今天的動物很相似；美洲大陸上的同種動物，從南到北，它們的形態逐漸不同；加拉帕戈斯群島的大多數生物都具有南美洲生物的特征，而群島各小島上的同種生物又多少有些不同。這些事實，有力地促使他產生了物種可變的思想，但是物種為什麼會變化，變化的規律是什麼，仍是個不解之謎。
麵對這些複雜而深奧的問題，達爾文明智地遵循了賴爾在地質學方麵研究的範例，決定采用“將今論古”的方法，麵向現實，麵向實踐，來解釋物種起源和變化的原因。他首先選擇了家養動物和栽培植物這條生產實踐的道路，去探索奧秘。他廢寢忘食地進行了15個月的係統調查，經常和育種家、園藝家交談、通信，從他們那兒搜集各種家養動物和栽培植物的變異材料和培育方法。他親自參與實踐，認真考察了小麥、玉米等農作物的選育過程，親自動手搞移植實驗；仔細地分析比較雞、鴨、鵝、牛、羊、豬、狗、貓等家禽家畜各個品種之間的差異，還著重研究了各種家鴿品種之間的差異和起源問題。這些卓有成效的研究工作，終於使他得出了如下結論：物種在人工幹預下是能夠改變的，家養動物和栽培植物的各種優良品種並不是上帝為了恩賜人類而分別創造出來的，它們是人民群眾經過世世代代人工選擇的結果；物種在人為條件下能夠發生進化；具有明顯不同特征的品種可以起源於共同的祖先。接著，達爾文又進一步研究了“在自然條件下又是什麼力量在起選擇作用”的問題。他聯係在環球考察期間發現的各種現象，結合多年觀察實驗積累的大量事實，提出了“自然選擇”即“適者生存”的理論。他認為：“在複雜的生存鬥爭中，對生存有利的變異，就會使物種有比較好的生存和發展的機會；而對生存有害的變異，卻會使物種難於生存，甚至滅絕。
自然選擇每日每時地在自然界檢查著生物最微小的變異，它像人工選擇一樣在起著汰劣留良的作用”。
1839年1月29日，達爾文在他將近30歲時，同他相愛多年的埃瑪在梅莊教堂舉行了婚禮。婚後，埃瑪不僅非常體貼丈夫，而且熱情支持達爾文的科學研究，經常替他整理和抄寫科學論文。達爾文由於在環球考察期間飽經風霜，曆盡艱辛，在以後的40年裏身體一直不好。特別是從1841年開始，經常感到周期性胸悶、胸痛和暈眩。埃瑪對達爾文無微不至的關懷和照顧，增強了他戰勝疾病去完成自己偉大事業的信心和力量。
1844年夏季，達爾文完成了辛勤耕耘的共計231頁的《物種起源》新提綱。這份提綱包括了後來正式出版的《物種起源》的主要內容。但他對此並不滿足，也不急於出版，而是堅持作進一步的補充。
1859年11月24日，《物種起源》第一版正式問世了。倫敦的幾家書店門口，人聲鼎沸，人們爭相購買剛剛出版的新書。1250冊書當天銷售一空。