男孩死後24小時，巴斯德把從死孩口中取出的唾沫加水稀釋，然後分別注射到五隻兔子的體中觀察，不久，這些兔子都得了狂犬病死去。巴斯德又從這些死兔的口中取出唾沫，加水稀釋後再注射到其它兔子的體內，這些兔子也都死了。
看來，唾沫中可能就有引起狂犬病的病原菌，巴斯德用顯微鏡反複觀察，卻怎麼也找不到病原菌。
“找不到病原菌，並不能認為就是沒有病原菌。……肯定是有的。找不到病原菌，就不能征服狂犬病！”巴斯德靜靜地思索著。
巴斯德的助手魯沃是個醫生，他從醫生的角度對狂犬病做了仔細的觀察，發現不論是狗還是兔子或是人，隻要得上狂犬病都要發生痙攣，不能吃東西，症狀完全一樣。經解剖觀察，知道了狂犬病主要是影響神經，當影響到脊髓後，就要出現神經麻痹而死亡。
於是，他提出一係列的設想：病原菌既然在病體的各個部位都找不到，肯定是在腦髓或脊髓中繁殖，如果用病體的腦髓接觸健康狗的神經，狗一定會發病。如果把帶菌的水注射到健康狗的腦髓裏，就—定會更快發病的。於是，魯沃向巴斯德提議說：
“先生，我們在狗的頭蓋骨上開一個洞，從這裏對腦髓進行注射觀察如何？”
“不，這種方法太殘酷了，在頭蓋骨上開洞，容易破壞腦髓，造成死亡。”巴斯德不以為然地回答。
就外科手術來說，在頭蓋骨上打洞並不是困難的大手術，這一點魯沃是清楚的。魯沃趁巴斯德外出的時候，在一隻健康的狗的頭蓋骨上開了一個洞，把帶菌的水注入狗腦中。
當巴斯德回來後，魯沃向他報告了事情的經過。
“唉，太殘酷了，可能已經死了吧？”巴斯德說。
這時，那隻頭上開過洞並綁著繃帶的狗從門外跑了進來，在巴斯德周圍歡快地擺動著尾巴。巴斯德摸摸狗的頭部說：
“可憐的小家夥！”
這隻狗終於在第十四天發病，於第十九天死去了。繼續用同樣的方法對十隻兔子進行實驗後，情況完全一樣，實驗證明了眼睛看不見的狂犬病的病原菌是在狗的腦髓裏。
他們想把過去培養雞霍亂疫苗的辦法應用到培養狂犬病的病原菌上來。這是一件複雜的工作，他們雖然絞盡了腦汁，但不論怎樣實驗，製造出來的疫苗都是毒性不減。
毒性不減怎麼能用於試驗注射呢？巴斯德和他的助手們都很焦急，但是又沒有更好的辦法。
一天，巴斯德在庭院中一邊散步，一邊想著對策，突然，他想出了一個方案，急忙回到研究室。
他首先摘下一個因狂犬病剛死的狗的腦脊髓，把它切成了小塊塊，裝到玻璃瓶中密封起來，把它和外部隔絕，以防浸進其它細菌。放在攝氏二十度左右的地方進行幹燥。
24小時後的第一天，巴斯德取出一點點給一隻狗做了實驗性的注射；48小時後的第二天，又取出一點點給另一隻狗進行注射……如此這般繼續下去，兩個星期後，也就是第十四天的時候，那隻第一天注射的狗開始發病，接著每天都按著注射的順序一隻接著一隻地發病，不久，又一隻接著一隻地死去了。
在他們實驗的小屋子裏，每天都有一隻實驗的狗死去。
說也奇怪。一天早晨，當助手到小屋來檢查時，卻發現有的狗沒有發病，同時，發病的狗也沒有死去。
第二天也是這樣，這是一個可喜的跡象。
“先生，發病的狗沒有死。”助手把情況報告了巴斯德。
“好，我們的實驗收到了效果。這是哪天注射的狗啊？ ”
“經過第十四天以後的幹燥物所注射的狗都沒有死。”
“太好了，我們現在再進行一次比較有把握的實驗。從今天開始，在剩下的兩隻狗身上，先用經過第十三天的幹燥物。再用經過第十二天的、第十一天的幹燥物，以逐步加強毒性進行實驗觀察。”
於是，一天一天注射下去，到了第十四天藥已用完了，按一般情況兩隻狗都應該發病，但是這兩隻狗都沒有發病。第一步取得了成功。
他們又把這兩隻狗移到患狗一起，進行另一次實驗，這兩隻狗既沒有發病又沒有死亡。他們又從獸醫那裏找來沒有進行過預防注射的兩隻狗，連同這兩隻經過多次實驗的狗放到病狗一起做第三次實驗。四隻狗都被患病的狗咬過，那兩隻沒經過預防注射的狗死了，而經過預防注射的兩隻狗卻安然無恙。
實驗證明是成功了。巴斯德和他的助手為此已經奮鬥了三年了。這時已是1881年了。