在20世紀的最初10年，隨著蛋白質學說的發展也產生了一些問題。其一，費歇爾的方法使他隻能將某些氨基酸合成為多肽，他首次合成的18個氨基酸的多肽鏈隻含有兩種氨基酸（亮氨酸和甘氨酸），而大多數天然蛋白質是含有很多氨基酸的。其二，他的分離方法隻能對天然蛋白質的氨基酸數目和種類作定量分析，而對這些氨基酸在整個肽鏈中的物理構型卻全然不知。
由於發現任一特定的蛋白質總是產生數量大致相同的各種氨基酸，進而使人聯想到，蛋白質具有一定的和重複的結構。有愈來愈多的有機化學家應用了費歇爾的方法。顯然，膠體學派不得不放棄關於所有蛋白質均無一定結合順序的斷言。費歇爾堅信原子有實際結構這一點，為他研究蛋白質提供了一條比那些相信不可知論及煩瑣的唯心論的化學家更確定、更迷人的途徑。費歇爾的工作證明了生命過程可以還原成純粹化學的相互作用。
費歇爾的蛋白質分子觀，是20世紀頭10年興起的酶學說的一個重要組成部分。許多“酵素”被認為是蛋白質或是類似於蛋白質的物質。然而，沒有任何跡象表明，蛋白質實際上是有一定組成的分子。用嚴格的化學方法去闡明酵素的催化作用總是比較困難的。那些曾擁護畢希納釀酶學說的年輕、熱情而激進的化學家，1897年後發現費歇爾工作中有一個著名的已確證的觀點，這就是所有的生化、生理反應都是由專一的酶所控製的。
然而，在此期間，費歇爾的多肽研究工作也遇到了非難。費歇爾自己幾乎沒有意識到他的多肽學說對酶學說的巨大含義。雖然他相信，蛋白質的一般特性符合多肽學說，但他不相信：①所有、或大多數酶是蛋白質；②作為蛋白質的酶具有專一性。例如，1907年費歇爾（和其他人）主張，酶不是真正的專一性的蛋白質，而是很小的催化分子，它們粘附在一些蛋白質狀的膠體物質上。事實上，當年費歇爾就被卷入到一場關於蔗糖酶（它催化某些糖降解）是不是蛋白質的爭論之中。費歇爾認為，蔗糖酶的蛋白質成分並沒有表現出專一性，並且可以用化學方法同酶的催化部分分開，因此，他認為蛋白質是一種被動的、與催化作用無關的載體。費歇爾雖然不是一個膠體學派的追隨者，但在20世紀初，他還是不能完全擺脫膠體學派思想的束縛。20世紀初的頭幾十年，在能否認識到催化作用是由像蛋白質那樣的大分子來執行這一點上，還存在著很大的知識方麵的障礙。對於大多數工作者來說，有機催化劑不過是像無機催化劑鉑金那樣的、很小的分子。
費歇爾的研究有幾個方麵被承襲下來了。他所使用的精確的定量方法，為有機化學、特別是為蛋白質化學建立了一套新的標準。20世紀初，這些方法對於與蛋白質研究緊密相關的各個生化領域都產生了相當大的影響。費歇爾的方法，尤其是人工合成多肽的方法，亦為探討蛋白質分子的精確結構和確切組成（即分析和合成）開辟了一條新的途徑。當時，還沒有一定的方法能證實費歇爾的研究。比如，他提出自然界中的蛋白質是以肽鍵相連而形成，如同實驗室中合成的含有18個氨基酸的肽一樣，這樣的觀點就無法被證實。1907年後的20年，人們才有可能認為蛋白質分子是有一定結構的，自然狀態下的蛋白質和費歇爾在實驗室裏合成的蛋白質很不相同。1910年至1935年，來自幾方麵的研究成果，使人們逐漸接受了蛋白質是具有一定的原子組成和專一結構的大分子這樣的觀點。
其中一方麵的研究工作主要是圍繞蛋白質的物理性質——大小及形狀——而進行的。費歇爾和他同時代的學者曾提出，分子量超過5000的蛋白質是不存在的。然而，1917年，丹麥化學家索倫·索倫森（1868～1939年）對蛋白質溶液進行了一係列的滲透壓研究，索倫森根據研究結果斷言，某些蛋白質（如蛋清清蛋白）的分子量大於34000（今天測得的值大約是45000）。1925年，瑞典物理化學家西奧多爾·斯維德伯格（1884～1971年），介紹了一種全新的技術，革新了確定生物大分子分子量的方法。他發展了一種稱為超速離心機的儀器，當含有各種分子的溶液在裏麵以很高的速度旋轉時，在一定的轉速下，分子密度越大，沉澱的速度越快。通過對分子的大小和密度作出幾種假定，斯維特伯格能夠精確地計算出蛋白質分子的重量。他證明了，像血紅蛋白這樣的蛋白質，它的分子量大約在66000以上。今天，超速離心法仍被用作精確測定分子量的方法。由此證明蛋白質是很大的分子，比20世紀初人們所設想的要大得多。由於發現相同的蛋白質有同樣的分子量，斯維德伯格進一步證明，蛋白質具有一定的大小和組成。
到20世紀20年代中期，膠體學派逐漸銷聲匿跡了。不過那些試圖更精確地證明蛋白質分子有一定組成的人，仍然麵臨著許多棘手的問題。一是很難得到純的蛋白質，即保證用於分析的樣品隻應含有一種蛋白質分子。另一個問題是充分地分離大蛋白質的降解產物（氨基酸的分離）有困難。第三個問題是還不能在實驗室裏合成含有所有氨基酸的多肽。1920～1950年，由於一係列研究的進展，才解決了其中的一些問題。