而是又回到了彌勒教授麾下，繼續做關於比較解剖學和動物學方麵的研究。然而不久，彌勒教授於1858年4月去世了。這一變故，導致海克爾隻好再回到維爾茨堡，掛牌行醫。雖然如此，海克爾還是舍不得離開自己所鍾愛的科學研究工作。這一年的夏天，他到耶魯大學去看望了那裏的動物學教授蓋根鮑爾。並在這位教授的提議下，首先設法得到了父親的同意和支持，然後滿懷信心地前往意大利的西西裏島，進行了一次很有收獲的考察。在這次曆時近兩年的考察活動中，海克爾采集到了包括144個放射蟲新種在內的大量標本。後來，海克爾把這些被他稱為“純潔而美麗的海雪花”的動物標本帶回意大利進行了分類和命名。在野外考察的間隙中，他還閱讀了達爾文寫的《物種起源》一書，使進化論的思想成為自己後來思考和研究生物學問題的基礎。也奠定了海克爾後來成為達爾文主義捍衛者和傳播者的基礎。
1861年3月，海克爾發表了他用進化論思想研究動物學的一篇論文——《論根足類動物的界和目》。這篇論文使海克爾得以進入著名植物學家施萊登領導的耶拿大學醫學院任教，成為這所大學的比較解剖學講師。一年後，他升任哲學係動物學副教授，並主管了動物博物館的工作。海克爾在教學中從來不把傳授知識作為惟一的目的，而是更加注重向學生介紹研究自然科學的方法。在上課時，他還時常用一些隨手畫就的圖形來幫助學生們學習和理解他所講授的內容，使他的課深受學生們的歡迎。
這一年，海克爾28歲，他娶了聰明美麗的表妹安娜塞思為妻。可是很不幸，兩年後他的這位妻子就因病去世了。1867年，形單影隻的海克爾再次結婚。他的第二位妻子叫阿格尼絲，是德國解剖學家胡希克的女兒。
海克爾的勤奮工作，換來了學術上的累累碩果。1865年，海克爾再次獲得晉升，成為教授和動物博物館館長；又過了一年後，他發表了自己的學術巨著《普通生物形態學》。
海克爾是十分崇拜達爾文的，他也是達爾文自然選擇學說的堅定捍衛者和積極傳播者。海克爾曾經以自己大量的著述和在講壇上一次又一次的演講，向公眾宣傳達爾文的自然選擇理論，為此，他在公眾中享有很高的聲譽。海克爾還發表過《人類發展史》、《生命的奇跡》和《作為宗教和科學之間的紐帶的一元論》等一係列融入進化論觀點的生物學專著。此外，他寫的《宇宙之謎》曾遭到唯心主義哲學家和神學家的猛烈攻擊，但是，這本書從1899年初版以來，至今已經被翻譯成30多種不同語言的版本，先後發行了幾十萬冊。雖然這本書並不隻是研究生物學的，它隻是以生物學理論為基礎的一本哲學能俗讀物，可是，在這本書中海克爾提出了“上帝”和“自然”其實是同一個事物或實體，物質和精神都是這個事物不可或缺的兩個屬性。這本書對“一元論”的哲學思想進行了係統和通俗的總結，是海克爾完整學術思想的重要組成部分。
海克爾既具有科學家的嚴謹，也具有藝術家的浪漫。他從小熱愛大自然，一生中所創作的風景畫就不下千餘幅。而在科學研究中，他既注重事實，也善於推理。在他被聘為耶拿大學教授以後，他先後到過許多地方親自進行科學考察。從大西洋的加納利群島、錫蘭島，到紅海、印度尼西亞的爪哇，到處都留下了他辛勤的汗水和足跡。他研究過海洋中的原生動物、海綿動物、腔腸動物、軟體動物、棘皮動物和一些脊椎動物等廣泛的動物類群。他在對四千多種海洋動物的全麵觀察、科學分類和胚胎發育等方麵研究的基礎上，首創了生物分界的“三界說”。並指出，在動物界、植物界和原生生物界之內，每“界”是由許多“門”組成的。
起初，海克爾研究動物的個體發生是分門別類逐一進行的。他觀察過動物的受精卵是如何經曆卵裂、形成囊胚、原腸胚再發育成幼體的；也曾將不同類型動物的發育過程進行過比較。
後來，他在研究家畜中豬的個體發育時，發現這種家養動物的個體發育和種係發生有許多相似之處：個體發育的起點是單細胞的受精卵，而係統發育理論認為多細胞生物就是由單細胞起源的；豬的早期胚胎具有鰓裂，而係統發育理論認為豬的祖先應是水生動物；豬在陸地上生活，而係統發育理論則認為陸生動物起源於水生環境，這些難道都是巧合嗎？為了進一步弄清這個問題，海克爾查找文獻資料，發現在大約半個世界前一位叫做梅克爾的解剖學家的奇妙猜想：一個物種可以從另一個物種演化而成，在高等動物的胚胎發育中，會在解剖結構和生理上重顯該物種的進化發展過程。然而，另一位叫做貝爾的動物胚胎學家又否定過海克爾的猜想。貝爾在他的著作《論動物的發育史·觀察與回顧》中指出：深入觀察脊椎動物發育史，就會看到各種胚胎無論在整體還是局部上都相似。貝爾通過深入的研究，歸納出了以下結論：