為了能得到更多的眼淚，他把檸檬汁擠進眼睛裏，逼出淚水。即使這樣，也仍不夠試驗用，他勸說工人們也這樣，無奈他怎麼勸說，工人們也不肯做。“你們給我眼淚，我給你們錢，每次三便士，怎麼樣？”工人們當然很高興，眼淚居然也可以賺錢！於是紛紛動手按照他說的去做。
經過多次實驗，他發現，人體除了鼻涕、眼淚外，許多組織的分泌物都可以溶解甚至消滅某些細菌。這種物質在體內產生，溶解消滅細菌的同時，對人體沒有任何傷害。他稱這種物質為溶菌酶。這雖是一項獨特的發現，但它並沒有很重要的實際意義，溶菌酶不能有效殺死那些對人體危害很大的病菌。
1928年，弗萊明在一次做實驗中，一個暴露在空氣中的金黃色葡萄球菌的培養基被一種青黴菌汙染了。一段時間後，弗萊明發現培養基中青黴菌周圍的細菌沒有了，而其他區域的細菌繼續生長。弗萊明推斷青黴菌產生了某種物質使這些有害病菌的生長受到抑製。很快他得到了有力的證據證明確實如他所推斷的，該物質抑製並殺死了許多病菌的生長。由於這種物質是青黴菌產生的，所以他將其命名為青黴素，當時他還發現青黴素無害於人和動物。
1929年元月9日，弗萊明的助手克拉多克不停地打噴嚏，弗萊明用有青黴素的肉湯清洗了克拉多克的鼻腔。三小時後，又洗了一次。克拉多克不再猛打噴嚏了。這是弗萊明第一次在病人身上成功地使用了青黴素。
弗萊明於同年將這一重大發現公布於眾。可一開始，人們並未認識到這項發現會給自己的健康帶來什麼重大益處。弗萊明強調指出青黴素若廣泛應用於醫學治療中，會有光輝的前景。
但是連他自己也不知道如何提純青黴素。就這樣，以後的十幾年中，青黴素一直沒有被廣泛應用，提純技術也一直沒有突破。
20世紀30年代末，霍德華·瓦爾特·弗洛裏和尼恩斯特·鮑裏斯·錢恩這兩位英籍醫學研究家，有一次看到弗萊明的論文，在重複了弗萊明的實驗，並證實了這一發現的正確性後，他們決定要想辦法提純這種神奇的物質。
青黴素的純度開始時非常低，要想提煉出能夠治療一個惡性病人的藥，就需要裝滿一節火車車廂的培養液。後來，他們曾用玉米汁培養黴菌，青黴素的含量一下提高了十倍；采用來自世界許多地方分離出的優良菌種，青黴素的產量從每立方厘米兩單位（一單位為0.625微克）一下子提高到40個單位。令他們激動不已的是在一個爛西瓜上找到的青黴菌，使青黴素的產量從每立方厘米40個單位猛增到200個單位。
1941年2月，一位紐約警察由於葡萄球菌感染到血液，情況危急而住院治療。12日，他成為全世界第一個接受青黴素注射的人。24小時後，這個生命垂危的病人，病況竟然大為好轉。
弗萊明對於這個令全人類都為之歡欣鼓舞的好消息，卻有自己的想法：“我想，賦予我的榮譽無論多大，比起我能否成為一種工具，在某種範圍內減輕人類痛苦這個希望，世上一切地位權勢便顯得無足輕重了。”
二戰期間，在美國的伯利漢城的柏西乃爾陸軍醫院，就是用這種叫做青黴素的藥品，在209名被醫生認為幾乎無法治愈的病人身上做了嚐試，結果206人都奇跡般地活了下來。
最開始，青黴素成了戰時傷員的專用品。一直到1944年，美國已有2000所青黴素倉庫，英美兩國公民才在治療中廣泛使用青黴素。二戰後，penicillin（青黴素的英文名稱）已是風靡全球，家喻戶曉了。
弗萊明、錢恩和弗洛裏三人也正因為這項偉大的功績同時被授予1945年度的諾貝爾生理學及醫學獎。
青黴素是人類發現的第一類抗菌素，以後，人們在青黴素的基礎上又找到了許多其他新型抗菌素，而久經“殺場”的青黴素卻一直擁有最廣泛的應用領域。
青黴素是用途最廣的抗菌素類，從流感引起的感冒和扁桃腺發炎，到白喉、猩紅熱、淋病和梅毒等嚴重危害人體健康的疾病，均可被青黴素有效地控製和治愈。
青黴素對於少數人會有較強的過敏反應，所以注射青黴素之前都要預先做皮膚過敏試驗，過敏體質者便排除在使用範圍之外了。對絕大多數人來說，青黴素是一種很理想的“高效無毒”藥。一個非過敏者，一天內注射100萬單位的青黴素也不會產生副作用，而實際50萬單位的劑量就可以有效地治愈一些疾病了。
1955年，偉大的醫學家弗萊明帶著成功，帶著人們給予他的厚愛，離開了人世，終年74歲。