南京政府成立後，國民黨內部並不統一，不久即出現了蔣介石和馮玉祥、李宗仁、閻錫山之間的軍閥戰爭，在1930年的中原大戰後，以蔣介石為首的南京國民政府取得了最後的勝利。國內的戰事剛剛平息不久，1931年9月18日，日本在東北又挑起了“九,一八事變”，1935年日本又製造了“華北事變”，中國民族的危機日益加深。在中國共產黨發出“停止內戰，以便集中一切國力去為抗日救國的神聖任務而奮鬥”的號召下，全國性的抗日救亡運動出現新的高潮，並推動著國民黨改變對日政策，使南京國民政府在內政、外交、經濟、教育、軍事等方麵開始著手準備抗戰，並試圖改善同中國共產黨的關係。1936年12月12日的“西安事變”成為扭轉時局的關鍵，國民黨決定接受共產黨抗日民族統一戰線的主張，國共兩黨開始重新和談。1937年7月7日，日本發動全麵侵華戰爭，國共兩黨加快了談判進度，9月22日國民黨中央通訊社發表了國共合作宣言。
抗戰爆發後，中國國民黨中央常務委員會於1937年8月成立國防最高會議，以其作為抗戰的最高統帥部，推舉蔣介石為陸海空軍大元帥。抗戰初期，國民黨在正麵戰場先後進行了22次大的會戰，1117次大型戰役，為有效遏製日軍的進攻，開辟敵後戰場客觀上起到了重要作用。抗戰進入相持階段後，盡管以蔣介石為首的國民黨親美英派多次挑起反共高潮，但國民黨正麵戰場的抗戰作用仍是不容忽視。其數百萬軍隊的存在，本身就是對日本軍隊的嚴重威脅，而隨著“珍珠港事件”後反法西斯戰爭同盟的形成，國民黨軍抗戰的積極意義更加明顯。抗戰期間國民黨軍隊共陣亡130萬人，受傷170萬人，以巨大的代價沉重地打擊了日本侵略軍。與此同時，由於國民黨實行消極抵抗的政策，在此時期也丟失了大片的國土。1940年3月，在日本帝國主義的幕後操縱下，以國民黨副總裁汪精衛為首的汪偽國民政府在南京成立。國民黨內以蔣介石為首的親美英派，在看到中國共產黨的敵後抗日武裝力量迅速發展，便產生了恐懼心理，其對內、外政策發生了變化。蔣介石以適應抗戰之需要為借口，擴張其權勢和地位。為獨攬黨、政、軍大權，蔣介石的幹將多次提出中國要實行“一個政黨、一個主義、一個領袖”。到1943年8月，蔣介石已身兼數職：國民黨中央總裁、國民政府主席、軍事委員會委員長、國民政府行政院院長。蔣介石獨攬黨政軍一切大權，實行獨裁統治。
1945年8月，抗日戰爭勝利，但國民黨蔣介石集團又在準備發動內戰，中國共產黨和國統區人民掀起了規模宏大的反內戰運動，迫使國民黨蔣介石不得不做出和平的姿態，同中國共產黨在重慶進行談判。在中國共產黨做出了較大讓步，國民黨也做了一定讓步的情況下，雙方簽訂了《雙十協議》，並於1946年1月10日至31日，在重慶召開了政治協商會議。這次會議通過了《和平建國綱領》、《關於憲草問題的協議》等，在不同程度上否定了國民黨的一黨專政、獨裁製度和內戰政策，但國民黨蔣介石很快就破壞了《雙十協定》和政治協商會議的決議案。1946年6月26日，國民黨軍向中原解放區發動大規模進攻，中國曆史上規模空前的內戰全麵爆發。全麵內戰開始不久，國民黨力量迅速從頂峰走向衰落。軍事上，國民黨遭到了慘重失敗，至1947年3月被迫由全麵進攻轉入重點進攻，到1947年7月又被迫轉入防禦。經過1948年9月到1949年1月的遼沈、淮海、平津三大戰役，國民黨賴以維持的軍事力量基本瓦解。政治上，國民黨發動內戰，失去民心，越來越陷入孤立，除少數的幾個黨外，多數黨派和政治組織都站在其對立麵。經濟上，四大家族大肆掠奪財富，和美國壟斷資本緊密結合，控製了中國的經濟命脈，使國民黨統治在經濟上麵臨崩潰。為挽救失敗的命運，蔣介石不得不提出和談的要求，但卻不願意接受“國內和平協定”。4月23日，人民解放軍占領了南京。7月，蔣介石從台北飛抵廣州召開“中央非常委員會會議”，企圖在西南地區進行最後掙紮，然而均遭失敗。不久，國民黨中央非常委員會遷往台灣。從此，國民黨結束了在大陸22年的統治。