公元75年，頗有作為的明帝去世，北匈奴和它的附屬政權乘機反攻，再次切斷絲綢之路。此前幾個親匈奴的國家如焉耆、龜茲等攻殺了東漢首任西域都護陳睦，匈奴聯合車師出兵包圍了戊己校尉耿恭(駐紮在車師後王部金蒲城，在今新疆奇台西北）。酒泉太守命秦彭等人大破車師於交河城，北匈奴見勢遁逃，車師國又歸降了漢王朝。但是，漢章帝因財政壓力反而召回戊己校尉與伊吾的屯田兵，也沒有派遣新的西域都護。結果蓄謀已久的匈奴又重新進兵占領了伊吾。雖然獨自留守的班超還在於闃一帶堅守，但中原王朝與西域的貢納關係又一次斷絕。
3.西域的二通二絕
公元89年，因刺殺太後幸臣未成的竇憲擔心被殺，請纓北擊匈奴以贖死，同時，早已歸順漢朝的南匈奴單於也請兵北伐。於是漢政府任命竇憲為車騎將軍，以執金吾耿秉為副將，各領四千騎兵，聯合南匈奴、烏桓、羌胡兵三萬多人出征北匈奴。
竇憲命令他的副校尉閻槃、司馬耿夔等率領精兵一萬多，在稽洛山（在今蒙古西北部）重創匈奴。匈奴騎兵潰散，北單於逃走，竇憲乘勝追擊到私渠比鞮海（烏布蘇諾爾湖）。這場戰爭匈奴13000多人被殺，俘獲牲畜超過百萬頭，戰後將匈奴20萬人組成81個部落並進行屯田。竇憲、耿秉登上了具有象征意義的燕然山（杭愛山），並勒石刻銘以記其事。第二年，竇憲還派遣副校尉閻槃率領2000餘名騎兵的軍隊向西域的匈奴根據地發起突然襲擊，奪回了漢朝戍軍在公元77年已從那裏撤退的伊吾(今新疆哈密）。接連失利、人心換散的北匈奴多次請求向漢稱臣。這時，南匈奴單於上書漢廷，建議乘機消滅北單於，然後，南北匈奴合並歸漢，漢廷欣然接受了這個建議。竇憲也認為北單於勢力微弱，想乘機將其徹底消滅，於是在91年，派右校尉耿夔、司馬任尚、趙博等率兵出居延塞，在金微山大破北匈奴單於騎兵，斬首五千餘級。北單於逃走，不知去向？班固等人追擊至私渠海（今蒙古杭愛山南），然後班師回朝。
漢朝取得的決定性勝利，十分有利於獨自留守的班超在公元91年平定西域，於是西域又回到漢朝懷抱。班超任西域都護，駐軍龜茲。漢廷又複置戊己校尉，領兵五百屯車師前部高昌壁（故城位於吐魯番市東45千米處火焰山南麓木頭溝河三角洲），又置戊部侯，屯車師後部。公元93年，班超又擊破焉耆，西域50餘國派遣質子帶著貢賦前往洛陽表示臣服。更遠的西域國家條支、安息等，直至地中海沿岸諸國，也都重歸交往。絲綢之路又一次貫通，中西交通形成了一次空前的盛況。這是西域第二次複通。
公元102年，班超因年邁申請回朝，繼任都護的任尚（之前為戍己校尉）剛愎自用、性情暴躁，不久便失和於西域各國，激起各國的反抗，攻圍任尚。四年後，朝廷調回任尚，由段禧接任西域都護，但戰亂依舊不止，而被征調前去鎮壓的羌兵又臨陣叛亂，切斷了河西走廊通道，西域第三次易手。朝廷於是下詔撤銷西域都護。此後十餘年間，卷土重來的北匈奴乘機收複諸國為其屬國，共同寇擾漢朝的邊境地區。這是西域絲綢之路第三次中斷。
公元119年，為了防禦北匈奴和西域諸國的侵擾，難郡太守曹宗派行長史索班率千餘人屯駐伊吾，招撫西域諸國，車師前王和鄯善王前來降附。但幾個月後，北匈奴又率車師後部攻擊伊吾，擊沒索班等，趕走車師前王。接著又進逼鄯善，鄯善向曹宗求救，曹宗欲報索班之恥，並進取西域，請出兵擊匈奴，但沒有得到朝廷允許，而僅僅是讓他在敦煌設置了護西域副校尉，用300人的軍隊對西域東部各國進行羈縻統治。後來北匈奴與車師聯合，人寇河西走廊，朝廷無奈，有人甚至還建議關閉玉門關和陽關，放棄西域。
4.西域的二通二絕
公元123年，繼任敦煌郡太守的張鏈與尚書陳忠上書朝廷，要求重新招撫西域。在奏章中張鐺現身說法，用自己從強烈放棄西域到堅定控製西域思想轉變的過程，曆數經營西域對河西乃至中原王朝的重要性。朝廷為此進行了討論，最後安帝釆納了他們的建議，決心在敦煌置校尉，並增加河西四郡屯兵，震懾匈奴，並且重新招撫西域諸國。
公元124年，東漢任命班超的兒子班勇為西域長史。班勇在大興屯田、備足糧草的基礎上，經過四年的努力，擊破車師。接著又先後招撫和平定了焉耆、龜茲、疏勒、於闐、莎車等國，西域17國皆附從漢朝，同時還大敗北匈奴，牢固地控製了今吉木薩爾和烏魯木齊一帶。實現了西域的第三次複通。從此以後，東漢對西域的統治日趨穩定，但烏孫、蔥嶺以西還是沒有能夠打通。永建六年（131)，順帝又令於伊吾屯田，並置伊吾司馬一人。
漢順帝統治期間，東漢朝廷在西域日益喪失威信，西域諸國對漢朝則日益驕慢，相互攻伐。最嚴重的是公元152年，於闐人還殺死了西域長史王敬。緊接著，公元153年車師後王反攻東漢屯兵的營地，漢王朝與西域的關係日益惡化。隨著東漢末年中原的戰亂，東漢最終喪失了對西域的控製權。