這段時期裏，東晉朝廷麵臨的內外形勢已相當嚴峻。出身於譙國桓氏的大士族桓溫，開始在政治上嶄露鋒芒。桓溫是晉元帝的駙馬，其父為桓彝。永和元年任荊州刺史，成為繼庾氏之後控製長江上遊的軍事勢力。永和三年，桓溫率兵平滅了成都的成漢政權，更是威名大振，朝野懼憚。為了遏製其勢力的膨脹，任撫軍大將軍、錄尚書六條事的輔政大臣會稽王司馬昱提出，讓褚太後征揚州刺史殷浩，令其參綜朝政。桓溫對此憤恨不已，遂自專荊、梁等八州之地，物資調賦不交國庫。
桓溫是位頗有進取之心，又懷政治野心的人。他曾屢次奏言北伐，都未得到朝廷許可。後來，他借口後趙石虎已死，在永和七年(351年)自作主張，率兵五萬順江而下，進駐武昌(今武漢)，引起朝廷驚慌。這一時期，殷浩奉命北伐數年，但進攻屢遭失敗，桓溫借機上表朝廷，請以誤國罪將殷浩罷職。褚太後無奈，隻得依言將殷浩廢為庶人。桓溫要挾朝廷除去殷浩以後，更是權勢日盛。
褚太後外有權臣壓迫，內受朝臣支配，十幾年來過得很艱難。終於盼到升平元年(357年)，14歲的兒子穆帝始加元服。她立即歸政，令穆帝親理國政。褚太後退居後宮，自享清靜。然而，天不遂人之願。升平五年(361年)五月，19歲的穆帝死於宮中顯陽殿。“親戚或餘悲，他人亦已”。青年喪夫的禇太後再遭致命打擊，兒子屍骨未寒，東晉王朝卻亂哄哄忙著選新皇帝。因為無子承嗣皇位，朝廷又搬出了褚太後，讓她下令，選立了琅玡王司馬丕，是為東晉哀帝，他的弟弟東海王司馬奕改封為琅玡王。桓溫被封為侍中、大司馬、都督中外諸軍事、錄尚書事、假黃鉞，但朝廷最終不敢讓桓溫入朝。
司馬丕已經成年，作為嬸母的褚太後自然沒有垂簾聽政的必要。也許是因為嬸母的冊立，也許是因為嬸母的影響力，司馬丕稱帝後僅僅封自己的生母周氏為皇太妃。東晉王朝仍然隻有褚太後這一位太後。
哀帝因為篤信方士之言食長生不老藥，漸漸發展到絕食的程度。到興寧二年(364年)春天，他已經無法親理政事。褚太後第二次被請出臨朝攝政。此刻，桓溫的權勢急劇上升，他又一次移鎮姑孰(今安徽當塗)，請求北伐。哀帝卻因食丹藥毒發，於興寧三年(365年)二月死於太極殿西堂，終年25歲。桓溫的北伐因哀帝的死也告停止。
哀帝死後，褚太後下詔迎立了司馬奕，是為晉廢帝(海西公)。但是，隨著權勢的日益增大，桓溫野心勃勃地想要篡位。於是發動了一次北伐想撈點政治資本，沒想到慘敗而歸。急於扳回顏麵的桓溫，竟想出了廢皇帝另立的招。他四處散播謠言，說晉廢帝當年做琅玡王時，就患陽痿，不能生育。他嬖寵相龍、計好、朱靈寶等人，參侍內寢，竟與他的妃子田氏、孟氏生了三個兒子……人們不知虛實，一時之間謠言四起，影響到政局的平穩。
桓溫認為時機已經成熟，太和六年(371年)十一月，他從鎮所直奔建康上奏褚太後，請求廢黜當今皇帝司馬奕，另立會稽王司馬昱為新君，把早已按褚太後口吻寫好的詔書也呈上。正在宮中佛屋中燒香的褚太後接到奏章，隻讀了一半，便不忍再看下去。隻得讓人拿來筆墨，按照桓溫草擬詔令的口氣批道：
未亡人(褚蒜子自稱)不幸，又遭此憂患，感念存沒，心如刀割。社稷大計，豈可兒戲，當此情景，怎可心軟!桓溫所奏，宜即敕準。臨紙悲塞，如何可言。