而“戊戌變法”失敗後，光緒被囚禁在中南海瀛台，失去了人身自由和政治權力。光緒急怒攻心，舊病複發。從光緒二十四年到光緒三十四年，光緒的身體再次垮了下來，病情日漸加重，直至去世。據光緒身邊的太監寇連材的《宮中日記》記載，宮廷中皇帝的膳食很豐富，常常有上百道菜，但因為光緒沒有權勢，所以連太監和廚師們都糊弄他，常常把上頓的剩菜下頓再擺出來，以致到後來大多數菜都發餿發臭，根本不能吃。常年累月地這麼吃，腸胃受不了，營養也跟不上。
在中國第一曆史檔案館所藏的《清宮醫案》（也稱《脈案》）中，清楚記載著光緒皇帝的“病例”。光緒二十五年的《脈案》中，記有光緒當時的身體狀況：脈搏微弱，麵色發黃，鼻子潰瘍，吃飯不香，消化不良，心情煩躁，時常歎息，氣短而懶於說話，精神恍惚，常常半夜醒來，對牆無故發笑。胸中鬱悶，虛火上升，脾胃不和。
到了光緒二十六年後，病入五髒，氣血雙虧，病勢不斷惡化，從未好轉。從現代醫學角度，這些症狀說明：光緒已患有嚴重的神經官能症、關節炎和骨結核以及血液係統的疾病，如此嚴重的病症如果繼續惡化，光緒皇帝的死好像也是順其自然之事。
光緒在37歲時自己也曾經撰文寫過自己的病況：“遺精之病將二十年，前數年每月必發十數次，近數年每月不過二、三次，且有無夢不舉即自遺泄之時，冬天較甚”，“腿、膝、足踝永遠發涼”，“稍感風涼則必頭疼體熱”，“耳鳴腦響亦將近十年”。
到光緒三十四年春季以後，光緒已經重病纏身，命不久矣的感覺。從《脈案》上的病錄可以清楚地了解到光緒的身體狀況：
光緒三十四年三月初九，肝腎陰虛、脾陽不足、氣血虧損、病勢十分嚴重。寒涼藥或溫燥藥皆不能用，幾乎無藥可用。
五月初十，“調理多時，全無寸效”。
七月十六日，江蘇名醫杜鍾駿為皇帝看過病後說：“我此次進京，滿以為能治好皇上的病，博得些微名。今天看來，徒勞無益。不求有功，隻求無過吧。”
九月，髒腑功能已經全部失調。
十月中旬，出現肺炎症及心肺衰竭的臨床症狀。
十月十七日，周景濤、呂用賓等三名禦醫會診，一致認為光緒已處於病危狀態。並私下對朝臣說：“此病不出四日，必有危險。”
十月十九日，出現胸悶氣短、咳嗽不斷、大便不通、清氣不生、濁氣下降、全身疲倦乏力等症狀。
二十日夜裏，光緒進入彌留狀態，肢體發冷、白眼上翻、牙關緊閉、神誌昏迷。
二十一日中午，光緒的脈搏似有似無、眼睛直視、張嘴倒氣。傍晚，“龍馭上賓”，光緒與世長辭。
由此可見，光緒從開始病重到臨終，病狀是一步步惡化的，沒有特別的症狀（如中毒或暴死）出現，應該是屬於正常病死。而從中也可以看出，光緒是由於多年來膳食問題加上精神方麵備受壓抑，在這種雙麵夾擊下導致的死亡。雖然期間的種種與慈禧太後的惡劣分不開，但慈禧也並沒有施與光緒最後的“致命一擊”。
但不同於上述觀點的另一種說法——光緒是被毒害的。
2003年，中央電視台清史紀錄片攝製組聯合清西陵文物管理處、中國原子能科學院反應堆工程研究設計所和北京市公安局法醫檢驗鑒定中心四個單位，組成“清光緒帝死因”專題研究課題組，運用最先進的技術和儀器，對光緒的遺骨、頭發、衣服等重新檢驗、分析後得到結論：光緒是死於砷（砒霜）中毒。
經測定，光緒頭發中的砷含量明顯高於正常值，是當代健康人的2000多倍，且高含量截段分布異常。是隆裕皇後的261倍和清代草料官的132倍，是慢性中毒患者最高含量的66倍，且砷分布曲線與慢性砷化物中毒者的砷分布曲線完全不同。也就是說，光緒砷中毒不是由於自身服藥而引起的，是忽然服食了大量的毒藥致死。
曾經身為清宮禦醫的屈貴庭在一本民國時期的雜誌《逸經》第29期上也發表過一篇文章：在光緒臨死的前三天，他最後一次進宮為皇上看病，發現光緒本已逐漸好轉的病情突然惡化，在床上亂滾，大叫肚子疼。沒過幾天，光緒便死了。也就是說，就這份記錄來看確實是忽然身體有異的症狀。
但究竟是誰對光緒下了毒呢？資料表明，慈禧、袁世凱、李蓮英三人嫌疑最大。
溥儀在《我的前半生》中記載，因為袁世凱在“戊戌變法”時出賣了光緒，如果光緒得回實權，肯定免不了要“報複”。所以袁世凱就在光緒病重期間，借進藥之機暗中下毒，將光緒帝毒死。