2. 試劑及材料
去離子水，氫氧化鈉(分析純)，生鮮豬肉。
3. 可視化微陣列芯片試劑盒
(1) 微量測試孔：每條8孔×12條，點樣有克倫特羅和萊克多巴胺。
(2) 標準液6瓶(0.5mL\/瓶，包括克倫特羅、萊克多巴胺混合標準液)
標準液濃度(ppb)克倫特羅CLEN萊克多巴胺RAC
標準品100
標準品20.070.07
標準品30.150.15
標準品40.300.30
標準品50.600.60
標準品61.201.20
(3) 抗體工作液6mL
(4) 二抗工作液6mL
(5) 顯色液A4mL
(6) 顯色液B4mL
(7) 20×濃縮洗滌液25mL
(8) 高濃度標準液0.5mL
(9) 10×組織稀釋液50mL
(10) 組織提取液5mL
4. 溶液配製
(1) 配液1：組織稀釋液
用去離子水將10×組織稀釋液按1∶9體積比進行稀釋(1份10×組織稀釋液+9份去離子水)。
(2) 配液2：0.5M氫氧化鈉溶液
稱取2.0g氫氧化鈉加入100mL去離子水溶解混勻。
(3) 配液3：洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用於芯片板的洗滌，洗滌工作液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
四、實驗步驟
1. 樣本預處理
(1) 稱取2.0g±0.1g均質後的樣本至50mL離心管中；
(2) 加入6mL組織稀釋液(配液1)和60μL組織提取液，2500rpm振蕩3分鍾，在4000g轉速下離心5分鍾；
(3) 取1mL上清液，用0.5M NaOH溶液調節pH至中性(約50μL)，振蕩10秒，10000g離心5分鍾；
(4) 離心後，取上層清液50μL用於檢測。
2. 檢測步驟
(1) 準備：使用前將芯片置於室溫(20~25℃)平衡30min以上。注意每種液體試劑使用前均須搖勻，所有試劑需避光保存；
(2) 取出需要數量的芯片微孔條插入框架中，確保其水平穩固。將不用的微孔條放入自封袋密封，保存於2~8℃，不要冷凍；
(3) 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，建議每個樣品和標準品均做雙孔平行；
(4) 加樣：依次加入50L樣品或標準工作液和50μL抗體工作液到各自的微孔中，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃ 600r\/m振蕩速度下反應 30min；
(5) 洗板：小心揭開使用蓋板膜，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液250μL\/孔洗滌反應孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍幹(拍幹後未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(6) 在每孔中加入二抗工作液50μL\/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，37℃ 600r\/m振蕩速度下反應30min，取出重複步驟6；
(7) 顯色：顯色液A和顯色液B臨用時1∶1混合均勻(注意：過早混勻將影響結果的檢測)，每孔加入混合液50μL，37℃ 600r\/m避光顯色約 12min， (如若微孔內黑色沉澱較深或較淺，可適當縮短或延長反應時間，但顯色時間應控製在11~13min內)取出重複步驟6；
(8) 測定：將顯色後的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，啟用默認的芯片專用軟件進行自動化分析，結果報告將自動生成。
五、注意事項
1. 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
2. 實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。
3. 向孔內移液時，移液頭朝向芯片的前邊緣，不要接觸芯片表麵。
4. 所有樣品和試劑的添加，洗滌和孵育都要在芯片架上完成。
5. 試管和容器都應該貼標簽，確保正確的樣品標識。
6. 注意不要使液體溢出，避免交叉汙染。
7. 在洗板過程中如果出現板孔內幹燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重複性不好的現象。應注意洗板拍幹後立即進行下一步操作。
8. 不要使用超過有效日期的芯片。不要交換使用不同批號的盒中試劑。稀釋試劑或摻雜使用芯片板條會引起靈敏度、信號值的變化。
9. 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。顯色液應嚴格避光保存，建議試劑盒開封後即用鋁箔紙包覆顯色液試劑瓶。顯色液應為無色澄清透明溶液，若有任何顏色或沉澱等表明已變質，應當棄之。
10. 標準品1的信號度值小於20000時表示試劑盒可能失效。
11. 該芯片最佳反應溫度為25℃\/37℃，每一步的溫度應該嚴格按照說明書設定，溫度過高或過低將導致檢測信號值和靈敏度發生變化。
12. 儲藏條件：為保證芯片試劑盒顯色正常，請收到試劑盒後將顯色液A、顯色液B放入－20℃冷凍保存，使用前在25℃解凍2小時。試劑盒內其餘組分放入2~8℃保存。
六、思考題
1. 影響可視化微陣列芯片試劑盒測定豬肉中瘦肉精準確度的因素有哪些？
2. 在本試驗中，為什麼樣品中瘦肉精的含量越高，顯色信號值反而低？
3. 計算結果時，本實驗中樣本的稀釋倍數是多少？
4. 試分析如果樣本pH最後沒有調成中性，結果會怎麼樣？
參考文獻
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[12] 鍾文英，李周敏，許丹科.微孔板蛋白芯片可視化檢測方法的研究[J].分析試驗室,2010,29(5).
實驗二可視化微陣列芯片試劑盒同時檢測
蜂蜜中的喹諾酮類和四環素族
一、目的和要求
1. 了解可視化微陣列芯片試劑盒檢測蜂蜜中喹諾酮和四環素的方法和原理。
2. 掌握蜂蜜樣本中喹諾酮類和四環素族同時檢測的前處理方法。
3. 掌握芯片試劑盒的檢測方法。
4. 通過對蜂蜜中喹諾酮類和四環素族檢測結果的分析，了解影響測定準確性的因素。
二、實驗原理
可視化微陣列芯片用於蜂蜜等樣品中抗生素殘留檢測是基於間接競爭免疫分析原理。可視化微陣列芯片微孔中包含有喹諾酮和四環素抗生素分子的人工抗原點，當在微孔反應區內加入待測抗生素樣品與相應抗體後，遊離的待檢物和芯片上固定的人工抗原點競爭結合相應的抗體。因此遊離的待檢物越多，抗體與固定在芯片上的相關抗原點的結合量就越少。待反應完畢洗滌後，加入納米催化顯色試劑，納米顆粒經催化反應而直徑顯著增加，在芯片表麵形成肉眼可見的黑色斑點。各黑色斑點通過芯片分析儀自動掃描檢測後可獲得各斑點的相關灰度值。由於樣品中殘留的抗生素含量與樣品的灰度值呈負相關，經芯片分析軟件與標準曲線自動比較計算後，即可得出各抗生素的含量，最終可實現多種抗生素的同時定量檢測。
三、儀器與試劑
1. 儀器
芯片分析儀（QArray 2000,祥中科技）；振蕩器；天平(感量0.01g)；容量瓶(100mL)；恒溫振蕩儀；聚苯乙烯離心管（15mL，2mL）；微量移液器(單道20μL~200μL，100μL~1000μL)。
2. 試劑與材料
去離子水，蜂蜜。
3. 可視化微陣列芯片試劑盒
(1) 微量測試孔：每條8孔×12條，點樣有喹諾酮和四環素抗原。
(2) 10×濃縮標準液6瓶(0.5mL\/瓶，包括QNs，TC混合標準液)，臨用前需10倍稀釋。
標準液濃度(ppb)喹諾酮類QNs四環素族TC
標準品100
標準品20.050.20
標準品30.100.40
標準品40.251.00
標準品50.602.50
標準品61.56.25
*以上濃度為稀釋後的標準品濃度。
(3) 抗體工作液6mL
(4) 二抗工作液6mL
(5) 顯色液A4mL
(6) 顯色液B4mL
(7) 20×濃縮洗滌液25mL
(8) 標準品稀釋液10mL
(9) 高濃度標準液0.5mL
(10) 10×蜂蜜提取液(若析出晶體，則溶解後使用)40mL
4. 溶液配製
(1) 配液1：洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用於芯片板的洗滌。配製後的洗滌工作液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
(2) 配液2：1×蜂蜜提取液
用去離子水將5×蜂蜜提取液按1∶9體積比進行稀釋(1份10×蜂蜜提取液+9份去離子水)配成1×蜂蜜提取液。配製後的1×蜂蜜提取液可在常溫下保存一個月。
*注意：10×蜂蜜提取液需搖勻後使用，若有晶體析出，必須溶解後使用。
四、實驗步驟
1. 樣本預處理
(1) 稱取1.00g±0.05g蜂蜜至10mL聚苯乙烯離心管中。
(2) 加入3mL的1×蜂蜜提取液(配液2)，2500r\/m振蕩3min。
(3) 取上述溶解後的溶液50μL(注意避開蜂蜜樣本中不溶性雜質)，加入200μL的1×蜂蜜提取液，振蕩混勻。
(4) 取50μL\/孔用於分析。
*注意：處理好的樣本溶液，請在2小時內完成檢測。溶液長時間放置後，四環素等極易降解，造成檢測結果偏低，產生假陰性。
2. 檢測步驟
(1) 準備：使用前將芯片置於室溫(20~25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻，所有試劑需避光保存；
(2) 取出需要數量的芯片微孔條插入框架中，確保其水平穩固，將不用的微孔條放入自封袋密封，保存於2~8℃，不要冷凍；
(3) 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，建議每個樣品和標準品均做雙孔平行；
(4) 加樣：依次加入50μL樣品或標準工作液和50μL抗體工作液到各自的微孔中，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃ 600r\/m振蕩速度下反應 30min；
(5) 洗板：小心揭開使用蓋板膜，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液250μL\/孔洗滌反應孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍幹(拍幹後未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(6) 在每孔中加入二抗工作液50μL\/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，37℃ 600r\/m振蕩速度下反應30min，取出重複步驟6；
(7) 顯色：顯色液A和顯色液B臨用時1∶1混合均勻(注意：過早混勻將影響結果的檢測)，每孔加入混合液50μL，37℃ 600r\/m避光顯色約 12min， (如若微孔內黑色沉澱較深或較淺，可適當縮短或延長反應時間，但顯色時間應控製在11~13min內)取出重複步驟6；
(8) 測定：將顯色後的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，啟用默認的芯片專用軟件進行自動化分析，結果報告將自動生成。
五、注意事項
1. 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
2. 實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。
3. 向孔內移液時，移液頭朝向芯片的前邊緣，不要接觸芯片表麵。
4. 所有樣品和試劑的添加，洗滌和孵育都要在芯片架上完成。
5. 試管和容器都應該貼標簽，確保正確的樣品標識。
6. 注意不要使液體溢出避免交叉汙染。
7. 在洗板過程中如果出現板孔內幹燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性、重複性不好的現象。應注意洗板拍幹後立即進行下一步操作。
8. 不要使用超過有效日期的芯片。不要交換使用不同批號的盒中試劑。稀釋試劑或摻雜使用芯片板條會引起靈敏度、信號值的變化。
9. 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。顯色液應嚴格避光保存，建議試劑盒開封後即用鋁箔紙包覆顯色液試劑瓶。
10. 顯色液應為無色澄清透明溶液，若有任何顏色或沉澱等表明已變質，應當棄之。標準品1的信號度值小於20000時表示試劑盒可能失效。
11. 該芯片最佳反應溫度為25℃\/37℃，每一步的溫度應該嚴格按照說明書設定，溫度過高或過低將導致檢測信號值和靈敏度發生變化。
12. 儲藏條件：為保證芯片試劑盒顯色正常，請收到試劑盒後將顯色液A、顯色液B放入-20℃冷凍保存，使用前在25℃解凍2小時。試劑盒內其餘組分放入2~8℃保存。
六、思考題
1. 影響可視化微陣列芯片試劑盒測定蜂蜜中喹諾酮和四環素準確度的因素有哪些？
2. 在本試驗中，為什麼樣品中喹諾酮和四環素的含量與顯色信號值呈反比？
3. 計算結果時，本實驗中樣本的稀釋倍數是多少？
參考文獻
[1] Li Zhonghui, Li Zhoumin, Xu Danke. Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in honey by using a visualized microarray screen assay[J]. Food Chemistry, 2017, 221: 18131821.
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[10] 左鵬，葉邦策.蛋白芯片法快速測定食品中氯黴素和磺胺二甲嘧啶殘留[J].食品科學,2007,(02):254258.
實驗三酶聯免疫試劑盒檢測雞肉中的氟苯尼考殘留量
一、目的和要求
1. 了解酶聯免疫試劑盒檢測雞肉中氟苯尼考的方法和原理。
2. 掌握雞肉中氟苯尼考檢測的前處理方法。
3. 掌握酶聯免疫試劑盒的檢測方法。
4. 通過對雞肉樣本中氟苯尼考檢測結果的分析，了解影響測定準確性的因素。
二、實驗原理
利用氟苯尼考抗體與氟苯尼考可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品(樣本)和氟苯尼考抗體，氟苯尼考藥物與固定在酶標板上的抗原競爭氟苯尼考抗體，最後加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品(樣本)中氟苯尼考藥物的含量成反比。
三、儀器與試劑
1. 儀器
酶標儀(檢測波長450nm、630nm)；振蕩器；離心機；天平(感量0.01g)；容量瓶(100mL)；恒溫振蕩儀；聚苯乙烯離心管（2mL，15mL）；微量移液器(單道20μL~200μL，100μL~1000μL)。
2. 試劑及材料
去離子水，雞肉。
3. 氟苯尼考酶聯免疫試劑盒
(1) 微量測試孔：每條8孔×12條，包被有氟苯尼考抗原。
(2) 標準品工作液：0ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb，6.4mL\/瓶。
(3) 酶標記物工作液：1瓶(7mL\/瓶)。
(4) 20×濃縮洗滌液：1瓶(30mL\/瓶)。
(5) 20×濃縮複溶液：1瓶(10mL\/瓶)。
(6) 底物A液：1瓶(7mL\/瓶)。
(7) 底物B液：1瓶(7mL\/瓶)。
(8) 終止液：1瓶(7mL\/瓶)。
(9) 高濃度標準液(0.5mL\/瓶)。
4. 溶液配製
(1) 樣本複溶液
用去離子水將20×樣本複溶液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)得樣本複溶液，樣本複溶液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
(2) 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用於孔板的洗滌，洗滌工作液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
四、實驗步驟
1. 樣本預處理
(1) 準確稱取1.0±0.05g均質後的組織樣本至5mL離心管中，加入 2mL 去離子水，劇烈渦動1min，4000g以上，離心5min。
(2) 移取50μL上清液，加入950μL複溶工作液中，劇烈渦動30s。
(3) 取50μL用於分析。
2. 檢測步驟
(1) 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，並記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗(每個樣本\/標準品點兩孔)，未使用的酶標板條用自封袋密封後，保存於2~8℃環境中以防變質；
(2) 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液\/樣品溶液50μL，再向每孔中加入50μL酶標記物工作液；
(3) 孵育：輕輕振蕩酶標板10s，使孔內液體充分混勻後，蓋好蓋板膜於25℃避光反應30min；
(4) 洗滌：取出酶標板後小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體後，在每孔加250μL洗滌工作液，浸泡15~30s後倒掉洗滌工作液，然後再加入洗滌工作液重複洗滌3~4次後，將酶標板倒置於吸水紙上，用力拍幹；
(5) 顯色：在每孔中加入100μL底物A和底物B的混合液(注：底物A液、底物B液必須按體積1∶1充分混合，混合液在10min內使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效)；
(6) 孵育：輕輕振蕩酶標板10s，使孔內液體充分混勻後，蓋好蓋板膜於25℃避光反應15min；
(7) 終止：在反應後的微孔中加入終止液50μL\/孔，底物液由藍變黃表明終止成功；
(8) 讀數：終止後的酶標板應在5min內用酶標儀讀數，建議使用 450nm、630nm雙波長讀取酶標板吸光度值。
五、結果計算
設各標準品(或樣品)的吸光度平均值為B，零標準(濃度為0ppb的標準品)吸光度平均值B0。以(B\/B0)×100%為各標準品(或樣品)對應的吸光度的百分比。
使用半對數係統代入標準品對應的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。
將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，最後乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。
X=A×f\/m×1000
式中，X為試樣中氟苯尼考的含量，μg\/kg或者μg\/L，A為試樣的百分吸光度值對應的磺胺的含量，μg\/kg或者μg\/L；f為試樣稀釋倍數；m為試樣的取樣量，g或者mL。
六、注意事項
1. 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書。
2. 試劑盒使用前，需將盒內各組分置於實驗台上回溫至室溫(25±2℃)(提示：約1h)。
3. 試劑使用前需搖勻，混合時應避免出現氣泡。
4. 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉汙染，檢測過程中所用槍頭不得重複使用。
5. 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
6. 樣品處理完畢後請立即分析，否則可能影響檢測結果。
7. 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合後立即變藍，說明試劑已汙染或變質。
8. 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產生影響。
9. 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水衝洗。若不慎入眼，請在徹底清洗後去醫院檢查。
七、思考題
1. 雞肉中氟苯尼考殘留量的檢測方法還有哪些？
2. 在本試驗中，雞肉樣本的稀釋倍數是多少？
3. 影響結果準確度的因素有哪些？
參考文獻
[1] Guo Lingling, Song Shanshan, Liu Liqiang. Comparsion of an immunochromatographic strip with ELISA for simultaneous detection of thiamphenicol, florfenicol and chloramphenicol in food samples[J]. Biomedical Chromatography, 2015, 29(9): 14321439.
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實驗四酶聯免疫試劑盒檢測牛奶中的磺胺殘留量
一、目的和要求
1. 了解酶聯免疫試劑盒檢測牛奶中磺胺的方法和原理。
2. 掌握牛奶中磺胺檢測的前處理方法。
3. 掌握酶聯免疫試劑盒的檢測方法。
4. 通過對牛奶樣本中磺胺檢測結果的分析，了解影響測定準確性的因素。
二、實驗原理
利用磺胺類藥物抗體與磺胺類藥物可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品(樣本)和磺胺類藥物抗體，樣本或標準品中的磺胺類藥物與固定在酶標板上的抗原競爭磺胺類抗體，最後加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品(樣本)中磺胺類藥物的含量成反比。
三、儀器與試劑
1. 儀器
酶標儀(檢測波長450nm、630nm)；振蕩器；氮吹儀；離心機；天平(感量0.01g)；容量瓶(100mL)；恒溫振蕩儀；聚苯乙烯離心管（2mL，15mL）；微量移液器(單道20μL~200μL，100μL~1000μL)。
2. 試劑及材料
去離子水，氫氧化鈉(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，正己烷(分析純)，市售牛奶。
3. 磺胺類酶聯免疫試劑盒
(1) 微量測試孔：每條8孔×12條，包被有磺胺抗原。
(2) 標準品工作液：0ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb，121.5mL\/瓶。
(3) 10×酶標記物濃縮液：1瓶(0.8mL\/瓶)。
(4) 酶標記物稀釋液：1瓶(8mL\/瓶)。
(5) 磺胺牛奶樣本提取劑：1瓶(6mL\/瓶)。
(6) 20×濃縮洗滌液：1瓶(30mL\/瓶)。
(7) 10×濃縮複溶液：1瓶(10mL\/瓶)。
(8) 底物A液：1瓶(7mL\/瓶)。
(9) 底物B液：1瓶(7mL\/瓶)。
(10) 終止液：1瓶(7mL\/瓶)。
(11) 高濃度標準液(0.5mL瓶)。
4. 溶液配製
(1) 酶標記物
用酶標記物稀釋液將10×酶標記物濃縮液按1∶9體積比進行稀釋。
(2) 樣本複溶液
用去離子水將10×樣本複溶液按1∶9體積比進行稀釋(1份10×濃縮洗滌液+9份去離子水)得樣本複溶液，樣本複溶液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
(3) 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用於孔板的洗滌，洗滌工作液在4℃(39.2℉)環境可保存一個月。
四、實驗步驟
1. 樣本預處理
(1) 取1.00g±0.05g牛奶樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加2mL樣本複溶液(配液1)，然後加入6mL乙酸乙酯；
(2) 渦旋後2500rpm振蕩10min(充分振蕩非常關鍵)，振蕩後4000rpm離心5min；
(3) 離心後，取3mL上層乙酸乙酯層於10mL離心管中，55℃氮吹幹；
(4) 加入1mL正己烷，2000rpm振蕩1min；
(5) 再加入500μL樣本複溶液，2000rpm振蕩3min；
(6) 振蕩後，5000rpm離心5min；
(7) 去除上層有機相，取出下層水相200μl至1.5mL離心管中用於分析(取出的下層水相中不得含有上層有機相)。
2. 檢測步驟
(1) 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，並記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗(每個樣本\/標準品點兩孔)，未使用的酶標板條用自封袋密封後，保存於2~8℃環境中以防變質；
(2) 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液\/樣品溶液50μL，再向每孔中加入50μL酶標記物工作液；
(3) 孵育：輕輕振蕩酶標板10s，使孔內液體充分混勻後，蓋好蓋板膜於25℃避光反應30min；
(4) 洗滌：取出酶標板後小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體後，在每孔加250μL洗滌工作液，浸泡15~30s後倒掉洗滌工作液，然後再加入洗滌工作液重複洗滌3~4次後，將酶標板倒置於吸水紙上，用力拍幹；
(5) 顯色：在每孔中加入100μL底物A和底物B的混合液(注：底物A液、底物B液必須按體積1∶1充分混合，混合液在10min內使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效)；
(6) 孵育：輕輕振蕩酶標板10s，使孔內液體充分混勻後，蓋好蓋板膜於25℃避光反應15min；
(7) 終止：在反應後的微孔中加入終止液50μL\/孔，底物液由藍變黃表明終止成功；
(8) 讀數：終止後的酶標板應在5min內用酶標儀讀數，建議使用 450nm、630nm雙波長讀取酶標板吸光度值。
五、結果計算
設各標準品(或樣品)的吸光度平均值為B，零標準(濃度為0ppb的標準品)吸光度平均值B0。以(B\/B0)×100%為各標準品(或樣品)對應的吸光度的百分比。
使用半對數係統代入標準品對應的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。
將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，最後乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。
X=A×f\/m×1000
式中，X為試樣中磺胺的含量，μg\/kg或者μg\/L，A為試樣的百分吸光度值對應的磺胺的含量，μg\/kg或者μg\/L；f為試樣稀釋倍數；m為試樣的取樣量，g或者mL。
六、注意事項
1. 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書。
2. 試劑盒使用前，需將盒內各組分置於實驗台上回溫至室溫(25±2℃)(提示：約1h)。
3. 試劑使用前需搖勻，混合時應避免出現氣泡。
4. 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉汙染，檢測過程中所用槍頭不得重複使用。
5. 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
6. 樣品處理完畢後請立即分析，否則可能影響檢測結果。
7. 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合後立即變藍，說明試劑已汙染或變質。
8. 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產生影響。
9. 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水衝洗。若不慎入眼，請在徹底清洗後去醫院檢查。
七、思考題
1. 牛奶中磺胺殘留量的檢測方法還有哪些？
2. 在本試驗中，為什麼牛奶中磺胺的含量越高，顯色信號值反而低？
3. 影響結果準確度的因素有哪些？
4. 氮吹未吹幹對結果有什麼影響？
參考文獻
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實驗五微分電位溶出法快速檢測食品中的重金屬殘留
一、目的和要求
(1) 了解微分電位溶出法的基本原理。
(2) 學會微分電位溶出儀的使用方法。
(3) 了解外標法進行定量分析的原理和方法。
(4) 掌握用微分電位溶出法測定食品中不同重金屬含量的方法。
二、實驗原理
鉛、鎘作為一種有害的重金屬元素，具有一定的蓄積性，在進入人體後，可由血液進入大腦神經組織，使氧氣和營養物質供給不夠，從而造成腦組織損傷，同時也會影響人的呼吸係統，嚴重損壞肺、腎等器官，甚至誘發癌症。有關衛生部資料表明，兒童血液中鉛的含量超過4.8μ mol·L-1時，就會出現智力發育障礙和行為異常。在都市的產業區內，兒童血鉛平均水平多為9.6～19.2μ mol·L-1，兒童鉛中毒的流行率多在85%以上，這比西方發達城市還要高。因此，研究食品中重金屬鉛、鎘含量否超標是一件迫在眉睫的事情。
目前，國家標準規定食品中重金屬的測定方法主要有石墨爐原子吸收光譜法、萃取火焰原子吸收光譜法、二硫腙比色法、氫化物原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發射光譜法、陽極溶出伏安法等。在這些方法中，石墨爐原子吸收、火焰原子吸收和電感耦合等離子體原子發射雖然具有靈敏度高、檢測限低的特點，但它們所使用的是大型儀器，
且樣品前處理步驟複雜、耗時長，不適合現場快速檢測。而陽極溶出伏安法具有儀器便宜，操作簡便等優點，易於推廣，將其應用於食品中重金屬的測定已經有了很多報道。但其采用的是三電極體係，最大的缺點就是電極的處理用時過長。針對以上問題，微分電位溶出法則完全可以滿足現場快速檢測的需求。
1. 微分電位溶出法
微分電位溶出法作為一種新的電化學方法，它采用一次性絲網印刷電極，極大地減少了處理電極的時間。其優勢在於靈敏度較高，重現性較好，操作簡便，設備便宜，易於攜帶，方便在戶外檢測。電位溶出法是在恒電位下被測物質預先電解富集在汞電極上形成汞齊，然後在陽極上氧化而溶出，用溶液中的氧化劑氧化電極上的電積物溶出，記錄電位—時間關係曲線。常規的電位溶出法形成的Et曲線，被測元素濃度大小決定了階梯平台的長度，不適合數據處理分析。而微分電位溶出(DPSA)能對電位溶出信號平台做微分化處理，得到峰電位和峰高。與常規電位溶出法相比，微分電位溶出法(dt\/dE)E曲線呈峰形，能有效增加信噪比，提高靈敏度。鑒於不同重金屬元素的峰電位是不同，根據溶出的峰電位的位置即可判斷出具體的重金屬元素，故峰電位用於定性；溶出峰的峰高與重金屬離子濃度在一定的濃度範圍內呈線性關係，根據溶出的峰高而得到重金屬離子濃度，用於定量。電位溶出法由於通過電解富集的方法，因此能夠檢測更低的濃度。
2. 外標法
根據不同情況，可選用不同的定量方法。外標法是在一定的操作條件下，用純組分或已知濃度的標準溶液配製一係列不同含量的標準溶液進行測量，根據峰高對溶液濃度做標準曲線。在相同操作條件下，依據樣品的峰高，由標準曲線確定其含量。
本實驗用去離子水超聲提取法對蔬菜等固體食品進行前處理，用酸化法對牛奶等液體食品進行前處理；用移液槍準確移取樣液和底液混合均勻於微分電位溶出儀上測量，記錄峰高，由標準曲線計算出重金屬的濃度。
三、儀器與試劑
1. 儀器
DPSA15重金屬檢測儀；一次性絲網印刷電極(如圖41所示)；KH400KDB型數控超聲波清洗器；分析天平（感量0.0001g)；真空幹燥箱；榨漿機；布氏漏鬥；錐形瓶；50mL燒杯；5mL量筒；25mL、250mL容量瓶;玻璃棒;聚四氟乙烯內罐;稱量紙。
圖41重金屬檢測儀和絲網印刷電極的實物圖
2. 試劑
鎘粒、鉛粉、醋酸汞、氯化鉀、過氧化氫、草酸銨、濃硝酸、活性炭、去離子水。
底液：① 稱0.0095g的醋酸汞，加入硝酸使之完全溶解。② 稱18.6375g的氯化鉀，加入適量的去離子水使之完全溶解(也可適當地加入稀硝酸)。③ 稱 3.5528g的草酸銨，加入適量的去離子水使之完全溶解(也可適當地加入稀硝酸)，④ 最後將上述配製的溶液全部轉移至250mL的容量瓶中，調節pH=2～3，後定容。
1mg\/mL鉛標準儲備液：準確稱取0.2500g的鉛粉置於50mL燒杯中，用適量稀硝酸溶解至完全，轉移至250mL的容量瓶，調節pH=1～2，後定容。
1mg\/mL鎘標準儲備液：按鉛標準儲備液方法配製。
3. 材料
蔬菜食品(茼蒿)、液態食品(牛奶)。
四、實驗步驟
1. 重金屬標準曲線繪製
用移液槍分別準確吸取1mg\/mL的鉛標準儲備液0.0025mL、0.005mL、0.0075mL、0.010mL、0.0125mL，置於5個25mL的容量瓶中，調節溶液pH=2～3，定容，分別移取100μL、300μL、400μL、500μL、800μL上述配好的溶液於一次性離心管中，按4∶1比例向離心管中加入400μL、1200μL、1600μL、2000μL、3200μL的底液，充分混合後，再用移液槍取 50μL 混合液滴在絲網印刷電極，選擇待測鉛元素，等待響應3min，記錄峰高，得出標準曲線圖。鎘的標準曲線按相同方法得到。
2. 樣品的前處理
① 蔬菜食品的前處理方法：以茼蒿為代表，用分析天平準確稱取5.000g的蔬菜勻漿，加入20mL的去離子水後，移入50mL的小燒杯中，放在數控超聲波清洗器上進行超聲提取，設定超聲提取的溫度為40℃，超聲提取的功率為40kHz，設定超聲提取的時間為5min，超聲提取完畢，加入適量的活性炭吸附蔬菜中的有機物，最後過濾至無色澄清溶液，移至25mL的容量瓶中，定容。按相同方法做空白實驗。
② 液態食品的前處理方法：以牛奶為代表，用分析天平準確稱取1.0000g牛奶置於聚四氟乙烯內罐中，加入2mL濃硝酸放置過夜。第二天，向其中加入2mL過氧化氫(注意其總量不可超過容器的1\/3)。蓋好容器，放入恒溫幹燥箱，在120℃下恒溫幹燥3h，待其在箱內自然冷卻後取出，轉移至25mL容量瓶中，用蒸餾水少量多次洗滌內罐，繼續轉移至容量瓶中，最後定容至刻度線，搖勻備用。按相同方法做空白實驗。
3. DPSA15微量元素檢測儀開機
(1) 打開儀器的開機鍵，聽到響應聲後，顯示屏出現亮屏表示開機成功。
(2) 進入儀器係統進行操作，選擇所要檢測重金屬的種類。
(3) 設置實驗條件，進行針對性的參數設置，本實驗中設置富集電位：-1.0V，富集時間：3min,停止電位：0.2V。
(4) 記錄樣品對應峰高，做相關數據處理。
(5) 清理儀器後，關閉儀器。
4. 樣品的測定
取前處理好的茼蒿溶液500μL加入2000μL的底液於小燒杯中充分混合，再用移液槍取50μL滴在絲網印刷電極，選擇待測鉛元素或鎘元素，等待響應3min，記錄峰高，對照標準曲線圖計算出鉛含量或鎘含量，平行實驗三次。牛奶樣品按相同方法得到鉛含量或鎘含量。
五、實驗數據處理
1. 繪製標準曲線
以質量濃度為橫坐標，峰高為縱坐標，繪製標準曲線，得到線性回歸方程和相關係數。
表41各標液的峰高記錄
編號鉛濃度C(μg\/L)峰高H(mm)鎘濃度C(μg\/L)峰高H(mm)
1
2
3
4
5
線性回歸方程
相關係數
2. 根據標準曲線計算樣品中鉛或鎘的含量
表42樣品中重金屬含量的測定
樣品測定次數峰高H
(mm)鉛含量
(mg\/kg)峰高H
(mm)鎘含量
(mg\/kg)鉛含量
RSD(%)鎘含量
RSD(%)
茼蒿
1
2
3
牛奶
1
2
3
六、注意事項
1. 微量元素檢測儀在使用中髒汙外表，可以用棉布沾潤清水(非濕透)擦拭儀器外殼，避免使用任何腐蝕性液體來清潔微量元素檢測儀。
2. 請小心保存DPSA15微量元素檢測儀，避免置於高溫、潮濕的環境。
3. 為了避免重金屬的二次無染，請將實驗中所產生的廢液倒入廢液桶中，集中處理。
七、思考題
1. 與其他電化學方法相比，微分電位溶出法有什麼優點？
2. 除了本實驗中蔬菜和液態食品所涉及的提取方法外，是否還有其他方法？
3. 用外標法進行定量分析有哪些優點？
參考文獻
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第五章實驗室現代分析儀器檢測實驗
第五章實驗室現代分析儀器檢測實驗
實驗一毛細管氣相色譜法測定酒樣中的甲醇
一、目的和要求
1. 了解氣相色譜法在酒品質量控製中的應用。
2. 掌握毛細管氣相色譜法的基本原理。
3. 掌握內標標準曲線法進行色譜定量分析的原理和方法。
4. 學習氣相色譜法測定不同酒樣中甲醇含量的分析方法。
二、實驗原理
在酒的釀造過程中，不可避免地會產生甲醇。甲醇是無色透明的具有高度揮發性的液體，是一種對人體有害的物質。甲醇可在人體內氧化為甲醛、甲酸，具有很強的毒性，對神經係統尤其是視神經損害嚴重，人食入5g就會出現嚴重中毒，超過12.5g就可能導致死亡。在酒的發酵過程中，難以將甲醇和乙醇完全分離，因此國家對白酒中甲醇含量做出嚴格規定。根據食品安全國家標準(GB 2757—2012蒸餾酒及其配製酒)，酒類製品中糧穀類釀造的酒類製品中的甲醇限量為0.6g\/L，其他原料釀造的酒類的甲醇限量為2.0g\/L。
氣相色譜法是一種高效、快速而靈敏的分離分析技術，具有極強的分離效能。一個混合物樣品定量引入合適的色譜係統後，樣品被汽化後，在流動相攜帶下進入色譜柱，樣品中各組分由於各自的性質不同，在柱內與固定相的作用力大小不同，導致在柱內的遷移速度不同，使混合物中的各組分先後離開色譜柱得到分離。分離後的組分進入檢測器，檢測器將物質的濃度或質量信號轉換為電信號輸給記錄儀或顯示器，得到色譜圖。利用保留值可定性，利用峰高或峰麵積可定量。
氣相色譜的進樣方法主要分為兩類：直接進樣和頂空進樣。直接進樣法將待測樣品溶液直接注入汽化室進行色譜分析。優點是操作簡單、快速，但隻適用於比較幹淨的液體樣品，對於含有不能汽化的物質的樣品必須通過處理才可進樣。頂空氣相色譜法按揮發組分的提取方式不同，可分為靜態法和動態法。靜態頂空法是將待測樣品置於密封的頂空瓶中，在一定溫度下，頂空瓶內氣液兩相達到平衡時，此時氣相中待測物濃度相對恒定。準確吸取上方氣體分析含量。優點在於它采用氣體進樣，可專一收集樣品中的易揮發性成分，與液液萃取和固相萃取相比既可避免在除去溶劑時引起揮發物的損失，又可降低共提物引起的噪音，具有更高靈敏度和分析速度，對分析人員和環境危害小，操作簡便，是一種符合“綠色分析化學”要求的分析手段，同時免除了複雜的樣品前處理過程，可用於氣體、液體、固體揮發性組分的分析。
目前市場上的酒類產品主要有白酒、啤酒、葡萄酒、保健酒，除了白酒樣品可以采取直接進樣法進行氣相色譜分析之外，其他類型的酒在分析前對樣品必須進行蒸餾或多次蒸餾，才可進入色譜儀。頂空氣相色譜法適合分析各種酒樣中的甲醇。
內標標準曲線法是在一定的操作條件下，用已知濃度的待測物溶液配製一係列不同濃度的標準溶液，並將標準溶液中加入相同濃度的內標溶液，準確進樣，根據色譜圖中組分的峰麵積與內標物麵積的比值對組分含量做標準曲線。在相同操作條件下，依據樣品中待測組分的峰麵積與內標物峰麵積的比值，從標準曲線上計算出其相應含量。
本實驗蒸餾除去發酵酒及其配製酒中不揮發性物質，加入內標(0酒精、蒸餾酒及其配製酒直接加入內標)，經氣相色譜分離，氫火焰離子化檢測器檢測，以保留時間定性，內標標準曲線法定量。
三、儀器與試劑
1. 儀器
GC2010型氣相色譜儀(日本島津)，配有氫火焰離子檢測器；H500型氫氣發生器；高純氮氣；空氣；5μL微量進樣針、10mL頂空進樣針(安捷倫)；5mL、10mL、25mL、500mL容量瓶；100mL圓底燒瓶；直形冷凝管；50mL移液管；移液槍(20μL～200μL)；HH2數顯恒溫水浴鍋。
2. 試劑
甲醇、乙酸丁酯、無水乙醇皆為色譜純；實驗用水均為實驗室自製二次去離子水；市售白酒、藥酒、葡萄酒、米酒、大麥酒。
四、實驗步驟
1. 標準溶液的配製
準確移取0.20mL甲醇(密度0.7918g\/mL)於10mL容量瓶用60%乙醇溶液定容至刻度線混合均勻待用，即為2%(體積分數)甲醇儲備液，濃度為15.84mg\/mL。準確移取0.20mL乙酸正丁酯(密度0.8825g\/mL)於 10mL 容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度線混合均勻待用，即為2%內標儲備液，濃度為17.65mg\/mL。係列甲醇標準混合溶液的配製：分別準確移取20μL、40μL、80μL、160μL、320μL 2%甲醇儲備液於10mL容量瓶中並逐一加入0.10mL 2%內標儲備液用60%乙醇定容，搖勻，待測。
2. 直接進樣法酒樣前處理
用50.00mL移液管準確量取50.00mL葡萄酒於100mL圓底燒瓶中，用適量二次蒸餾水分三次潤洗移液管，潤洗液並入圓底燒瓶中，再放入幾粒磁力攪拌子，連接冷凝管，用50mL的容量瓶作接收器。蒸餾完成，在4℃冰箱保存待用。藥酒、米酒、大麥酒前處理方法和葡萄酒相同。
3. 色譜條件
3.1直接進樣法
色譜柱：Rtx5型(30m×0.32mm×0.25μm)熔融石英毛細管柱；柱流量：1mL\/min；
載氣：氮氣，(純度>99.999%)，流量為20mL\/min；
進樣口溫度：240℃；
程序升溫：柱溫35℃保持4min，以5℃\/min升溫至120℃；再以 50℃\/min 升溫至210℃；
檢測器溫度：220℃；分流比：50∶1；
助燃氣：空氣，流量為350mL\/min；
燃燒氣：氫氣(純度>99.999%)，流量為35mL\/min；
進樣體積為0.30μL。
3.2頂空進樣法
色譜柱：Rtx5型(30m×0.32mm×0.25μm)熔融石英毛細管柱；
載氣：氮氣，(純度>99.999%)，流量為20mL\/min；
柱流量：1mL\/min；
進樣口溫度：220℃；
檢測器溫度：250℃；分流比：50∶1；進樣體積為1mL；
程序升溫：柱溫40℃保持8min，以5℃\/min升溫100℃；再以 40℃\/min 升溫至180℃保持4min；
助燃氣：空氣，流量為350mL\/min；
燃燒氣：氫氣，(純度>99.999%)，流量為35mL\/min；
頂空進樣條件：移取2.00mL樣品溶液，頂空瓶加熱溫度80℃，平衡時間20min，進樣體積1.00mL。
4. 色譜分析
4.1定性分析
按3.1和3.2的色譜條件分別進甲醇、乙酸丁酯得到甲醇和乙酸丁酯的色譜圖，記錄各自的保留時間,標出色譜圖中各峰的歸屬，甲醇標準溶液(含乙醇和內標)的色譜圖如圖51、52所示。
圖51甲醇標準溶液的色譜圖(直接進樣法)
峰a:甲醇；峰b:乙醇；峰c：乙酸正丁酯
圖52甲醇標準溶液的色譜圖(頂空進樣法)
峰a：甲醇；峰b：乙醇；峰c：乙酸丁酯
4.2內標標準曲線的繪製
直接進樣法：分別移取標準溶液0.30μL依次進樣，記錄色譜圖，根據保留時間進行定性分析，記錄甲醇和內標的麵積，並以甲醇與內標的麵積的比值對甲醇的濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程(含相關係數)。
頂空進樣法：分別移取標準溶液2.00mL置於頂空瓶中加入0.10mL 2%內標儲備液，加蓋，壓緊搖勻後以80℃水浴加熱20min，頂空進樣針吸取1.00mL瓶內上層氣體進樣分析，記錄色譜圖。根據保留時間進行定性分析，記錄甲醇和內標的麵積，並以甲醇與內標的麵積的比值對甲醇的濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程(含相關係數)。
4.3樣品分析
直接進樣法：準確移取蒸餾處理後酒樣10.00mL加入0.10mL 2%內標儲備液，搖勻，待測。移取0.30μL進樣分析，記錄色譜圖，根據保留時間定性分析，記錄甲醇和內標的麵積，計算甲醇與內標的麵積比值，代入直接進樣法中的內標標準曲線的線性回歸方程計算酒樣中甲醇的含量。
頂空進樣法：準確移取未處理酒樣10.00mL加入0.10mL 2%內標儲備液，搖勻。移取2.00mL至頂空瓶中加蓋，壓緊搖勻後以80℃水浴加熱 20min。待儀器基線穩定，頂空進樣針吸取1.00mL瓶內上層氣體進樣分析，記錄色譜圖。根據保留時間定性分析，記錄甲醇和內標的麵積，計算甲醇與內標的麵積比值，代入頂空進樣法中的內標標準曲線的線性回歸方程計算酒樣中甲醇的含量。
五、數據記錄與處理
1. 給出甲醇標準溶液(含內標)的色譜圖，並確定色譜圖中甲醇、乙酸丁酯色譜峰。
2. 根據4.3.2內標標準曲線繪製的實驗方法，以表格的形式分別記錄直接進樣法和頂空進樣法中各標準溶液色譜圖中甲醇和內標的麵積，並計算甲醇與內標的麵積比值，根據這兩個表格分別繪製內標標準曲線，進行線性回歸，得到直接進樣法與頂空進樣法的線性回歸方程。
3. 分別給出直接進樣法和頂空進樣法測定同一酒樣的色譜圖，記錄色譜圖中甲醇和內標的麵積，並計算甲醇與內標的麵積比值，帶入相應的線性回歸方程，計算酒樣中的甲醇含量，並判斷該酒樣甲醇含量是否超標。
六、注意事項
頂空進樣必須用氣密性進樣針，且吸取樣品後需要盡快進樣。
七、思考題
1. 比較直接進樣法與頂空進樣法對同一酒樣的測定結果，判斷兩種方法的測定結果是否有顯著性差異？
2. 測定白酒樣品是不是一定需要蒸餾處理，能否直接吸取白酒樣品進行色譜分析？為什麼？
參考文獻
[1] 申科敏，胡曉琴.頂空進樣—毛細管柱氣相色譜法測定酒中甲醇的含量[J].食品與藥品,2016,18(5):358360.
[2] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會,國家食品藥品監督管理總局.GB5009.2662016食品安全國家標準食品中甲醇的測定[S].2016.12.
[3] 孟雄飛,彭加強,寸宇智,楊衛花,趙浩軍.氣相色譜法同時測定酒中的甲醇、乙酸乙酯、己酸乙酯等10種成分[J].雲南化工,2017,44(4):6670.
實驗二高效液相色譜法檢測生鮮食品中的硝基呋喃殘留
一、目的和要求
1. 學會使用高效液相色譜儀測定雞肉中的硝基呋喃殘留。
2. 掌握加標回收率實驗的方法及計算方法。
3. 學會使用外標法色譜定量方法。
二、實驗原理
呋喃唑酮，通用名稱：痢特靈；英文名稱Furazolidone；化學名稱：3(5硝基糠醛縮氨基)唑烷酮；分子式：C8H7O5N3；相對分子質量：225.16。
呋喃它酮，別名：呋嗎唑酮；英文名稱Furaltadone；化學名稱：5(4嗎啉基甲基)3(5硝基2呋喃亞基氨基)2惡唑啉酮；分子式：C13H16N4O6；相對分子質量：324.29。
硝基呋喃類藥物因為價格較低且效果好，從而廣泛應用於畜禽及水產養殖業，以治療由大腸杆菌或沙門氏菌引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病、潰瘍病等。由於硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎副作用，個別國家已經禁止硝基呋喃類藥物在畜禽及水產動物食品中使用，並嚴格執行對水產品中硝基呋喃的殘留檢測。中華人民共和國農業部於2002年12月24日發布的公告第235號及於2005年10月28日發布的公告第560號，硝基呋喃類藥物為在飼養過程中禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出。自此，在動物飼養過程中使用硝基呋喃類藥物成為非法行為。硝基呋喃類抗生素對光敏感，在動物體內代謝很快，半衰期一般為幾個小時，因此，準確檢測動物組織中硝基呋喃母體藥物是比較困難的，也不足以反映其真實的殘留水平。但其代謝物則會以結合態形式在體內殘留較長時間，是硝基呋喃類藥物的標記殘留物。
由於高效液相色譜法準確、穩定、高效，因此高效液相色譜法成為硝基呋喃類藥物檢測的重要的分析方法。
三、儀器與試劑
1. 儀器
安捷倫高效液相色譜儀(配DAD檢測器)；超聲清洗器；電子天平（感量0.0001g)；旋轉蒸發儀；循環水式多用真空泵；微型渦旋混合儀；Supel clean ENVI18 SPE柱；微孔濾膜(0.22μm)。
2. 色譜條件
C18柱，150mm×4.6mm，粒度5μm;流動相：乙腈：0.3%乙酸(20∶80);流速：1.0ml\/min;檢測波長：365nm;柱溫：25℃。
3. 試劑
市售新鮮雞肉、呋喃它酮(色譜純)、98%呋喃唑酮(色譜純)、乙腈(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純)、0.3%乙酸(分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、甲醇(色譜純)，去離子水。
四、實驗步驟
1. 標準溶液的配製
1.1呋喃唑酮、呋喃它酮標準溶液的配製
稱取呋喃唑酮、呋喃它酮藥品各10mg(精確到0.0001g)，用少量乙腈溶解後，再用甲醇稀釋並定容至100mL棕色容量瓶中，在冰箱中冷藏保存，保存期一個月。該液中含呋喃唑酮、呋喃它酮100μg\/mL。使用前，量取呋喃唑酮、呋喃它酮標準液，用流動相稀釋成濃度為1μg\/mL的標準工作液。
1.2呋喃唑酮、呋喃它酮標準曲線的繪製
分別取呋喃它酮、呋喃唑酮濃度為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00μg\/mL 標準溶液各20μL,在上述色譜條件下進樣檢測。根據色譜圖以峰麵積為縱坐標，以濃度為橫坐標，線性擬合，繪製標準曲線，得到線性回歸方程。
2. 樣品前處理
取新鮮雞肉切成細小顆粒，冷凍保存備用。
2.1提取
稱取10g(精確到0.0001g)處理好的樣品於燒杯中，加入10g無水硫酸鈉和40mL乙腈攪勻分散後，超聲萃取10min,5000r\/min離心5min,取上層清液於棕色分液漏鬥中，沉澱物加入20mL乙腈渦旋3min，超聲萃取 10min，5000r\/min離心5min，取上清液合並於棕色分液漏鬥中，加入經乙腈飽和的正己烷 25mL 於棕色分液漏鬥中，振提3min，去掉正己烷層，濾液置於蒸發燒瓶中，濾液於旋轉蒸發儀上在45℃以下旋轉蒸發去除溶劑，蒸發速度控製在 2mL\/min。
2.2活化小柱
小柱臨用前，先用3mL乙酸乙酯和3mL甲醇3min內勻速流過小柱使其活化，再用5mL純水淋洗後即可使用。
2.3淨化
用2.0mL流動相溶解殘渣並充分洗滌蒸發燒瓶，將液體移入經活化的小柱淨化，3mL乙酸乙酯洗脫待測分析物，洗脫液加入蒸發燒瓶旋轉至近幹，殘渣用1mL流動相溶解定容至10mL，經0.22μm膜孔濾器過濾後進行HPLC分析。同時取乙腈不加試樣外，按上述步驟操作進行空白試驗。
3. 回收率的測定
采用加標法測定回收率，取6份10g經粉碎後的雞肉，分別加入呋喃唑酮4.00、8.00、10.00mg\/L(1mL、2mL)標準溶液，經過上述提取和淨化的步驟，最後上機檢測。
4. 檢出限
取濃度為1mg\/L呋喃唑酮、呋喃它酮標準溶液各20μL進樣，測定，然後逐級稀釋，進樣測定，直到呋喃唑酮、呋喃它酮主峰的峰高是周邊基線噪音的3倍，則此時的濃度為呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限，平行3次。
五、數據記錄與處理
1. 標準曲線的繪製
表51呋喃它酮標準曲線的有關數據
呋喃它酮的
濃度mg\/L2.004.006.008.0010.0012.00
峰麵積
表52呋喃唑酮工作曲線的有關數據
呋喃唑酮的
濃度mg\/L2.004.006.008.0010.0012.00
峰麵積
雞肉中呋喃它酮、呋喃唑酮含量的計算：根據標準曲線計算。(注意有空白實驗，計算時需要去除)
2. 雞肉中呋喃唑酮、呋喃它酮殘留的HPLC檢測：用雞肉色譜圖與空白樣圖進行比較，判斷是否還有殘留。
3. 回收率實驗
表53呋喃它酮加標檢測回收率實驗的有關數據
加標呋喃它酮
的濃度mg\/L4.008.0010.00
加標量\/mL1.002.001.002.001.002.00
雞
肉
進樣量\/μL202020202020
峰麵積
回收率%
表54呋喃唑酮加標檢測回收率實驗的有關數據
加標呋喃唑酮
的濃度mg\/L4.008.0010.00
加標量\/mL1.002.001.002.001.002.00
雞肉
進樣量\/μL202020202020
峰麵積
回收率%
4. 檢出限:由實驗測出呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限分別為多少。
六、注意事項
1. 實驗過程中使用的無水Na2SO4必須經過高溫灼燒,否則影響除水效果。
2. 正己烷必須用乙腈飽和,否則造成樣品除脂時流失,導致測定結果不準確。
3. 在濃縮溶液時,速度勿快,否則導致呋喃唑酮、呋喃它酮被蒸汽帶出,導致測定結果偏低。
4. 蒸發速度控製在2mL\/min,溫度在45℃以下。
5. 硝基呋喃類藥物在高溫、光線、空氣暴露等條件下,會部分降解,故實驗過程中,盡可能避光,室溫小於25℃條件下操作。
6. 所用器皿應盡可能采用棕色,標準溶液和樣品在冷藏、避光條件下保存,樣品應盡快分析。
七、思考題
1. 本實驗采用了什麼方法來進行樣品前處理的，還可以使用哪些方法來處理樣品？
2. 本實驗采用了高效液相色譜法來測定，還可以有哪些技術來測定？
實驗三高效液相色譜法檢測飲品中的塑化劑殘留
一、目的和要求
1. 了解塑化劑對人體的危害。
2. 學會使用高效液相色譜儀測定飲品中的塑化劑殘留。
3. 掌握加標回收率實驗的方法及計算。
二、實驗原理
隨著食品工業的迅猛發展，食品添加劑在人們生活中發揮的作用日益顯著。近年來，食品安全屢遭質疑，人們對食品中塑化劑添加含量的檢測提出了更高的要求。塑化劑是被非法添加到食品中的化工原料，它所替代的起雲劑原本是食品合法添加劑，主要以精製棕油為主，但棕桐油成本高，製造商為降低成本，加入塑化劑代替棕桐油。長期食用塑化劑會引起生殖係統異常，甚至造成畸胎、癌症。2011年，“起雲劑”事件在台灣鬧得沸沸揚揚，被稱為30年來，台灣最嚴重的食品安全事件，當地媒體將其比作台灣版的“三聚氰胺”事件。塑化劑的毒性比三聚氰胺強20倍，成人每天承受量為1.2毫克，一個人喝一杯500mL摻了塑化劑的飲料，就達到了承受的上限。所以，塑化劑的檢測日益受到廣泛關注與重視。
下文采用高效液相色譜法對奶茶中塑化劑含量進行檢測。
高效液相色譜法HPLC是20世紀60年代70年代初發展起來的一種新型分離分析技術，經不斷地改進和發展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。高效液相色譜儀一般可分為4個主要部分：高壓輸液係統(儲液器、高壓泵、脫氣器)，進樣係統，分離係統和檢測係統，此外還配有輔助裝置：如梯度洗脫、自動進樣及數據處理等。其工作流程是：首先高壓泵將儲液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然後從控製器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然後依先後順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。高效液相色譜法在食品安全性檢測和分析方麵應用範圍很廣，具有分離效率高，速度快，流動相可選擇範圍寬，靈敏度高，流出組分容易收集的優點，既可用於定性，也可用於定量。利用高效液相色譜的優點對奶茶中塑化劑含量進行研究。
三、儀器與試劑
1. 儀器
安捷倫高效液相色譜儀(配DAD檢測器)；超聲波清洗機；電子天平（感量0.0001g）；高速離心機；Supelclean ENVI18 50×3mL tubes，60mg小柱；微型旋渦混合儀；250mL容量瓶。
2. 試劑
鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)(分析純)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)(分析純)，正己烷(分析純)，甲醇(色譜純)，奶茶，實驗用水為二次去離子水。
3. 色譜條件
C18柱(5μm，150mm×4.6mm)；流動相∶甲醇∶水(85∶15)；流速：1.0mL\/min；進樣量：20μl；檢測波長：230nm。
四、實驗步驟
1. 標準儲備液的配製
分別稱取塑化劑標準品(DEP和DBP)各0.2500g，用甲醇溶解後定容至250mL容量瓶中，搖勻，配成總濃度均為1.000g\/L的塑化劑標準品溶液。
2. 混合標準溶液的配製
稱取塑化劑標準品(DEP和DBP)各0.2500g，用甲醇溶解後定容至 250mL 容量瓶中，搖勻，配成同濃度的含有塑化劑的混合標準品溶液。
3. 標準曲線的繪製
將塑化劑標準儲備液配成濃度分別是0.16、0.32、0.48、0.64、0.80mg\/L的標準溶液，經0.22μm濾膜過濾後，取20μL注入色譜儀，測定峰麵積，以峰麵積對濃度(mg\/L)作標準曲線。
4. 飲料前處理
4.1淨化
活化：依次加入5mL丙酮，5mL正己烷，棄去流出液。
4.2提取
移取樣品5.00mL於試管中，加入3mL正己烷，渦旋2min，以不低於 4000r\/min 的轉速離心1min，將上清液轉移至潔淨的試管中，再以2mL正己烷重複提取2次，合並三次上清液，40℃下氮氣吹至2mL，待淨化。
（向小柱中加入1g無水硫酸鈉)
上樣：加入待淨化液，流速控製在1mL\/min內；
洗脫：依次加入5mL正己烷、5mL 4%丙酮正己烷溶液，收集流出液，在40℃的溫度，緩慢氮氣流條件下吹至近幹(約0.5mL)後揮幹，甲醇定容至1mL，取20μL供HPLC檢測(如含有少量油滴，離心後取清液進行檢測)。
5. 回收率測定
在空白樣品處理後添加3個不同量的標準混合溶液，前處理及分析方法如飲料前處理中所述。
6. 檢出限
以樣品被測組分峰高為基線噪音的3倍時的濃度為最低檢出濃度(檢出限)。
五、數據記錄與處理
1. 標準曲線的繪製
表55DBP標準曲線的有關數據
DBP的濃度
mg\/L0.160.320.480.640.80
峰麵積
2. 含量計算：根據標準曲線計算
表56DEP標準曲線的有關數據
DEP的濃度
mg\/L0.160.320.480.640.80
峰麵積
3. 加標回收率
表57DBP的回收實驗
本底值\/g加標值\/μg測量值\/μg回收率%
00.8
02
04
00.8
02
04
4. 檢出限：由實驗得出塑化劑的檢出限。
六、注意事項
1. 常用的溶劑有三氯甲烷、甲醇和乙醇等。由於三氯甲烷毒性較大，且對色譜柱有一定的損傷作用，乙醇溶液對於標準品溶出效果不佳，故本實驗選擇甲醇作溶劑。
2. 實驗過程中使用的無水Na2SO4必須經過高溫灼燒，否則影響除水效果。
七、思考題
1. 自行查找國家規定食品添加劑中DBP及DEP的最大殘留量是多少，判斷實驗所測得樣品中DBP及DEP是否超出國家規定的限值。
2. 除了本實驗所用的高效液相色譜法測定外，還有哪些技術可以測定？
實驗四固相萃取高效液相色譜法測定
奶粉中三聚氰胺的含量
一、目的和要求
1. 學會使用固相萃取的前處理技術。
2. 學會使用高效液相色譜儀測定奶粉中三聚氰胺。
3. 掌握加標回收率實驗的方法及計算方法。
二、實驗原理
2008年奶製品汙染事件是中國發生的一起影響範圍很廣的食品安全事故。經國家有關部門調查確認是奶製品廠商在嬰兒奶粉中添加了大量的有“假蛋白”之稱的三聚氰胺，從而造成奶製品蛋白含量虛高的假象。而食用過一段時期含三聚氰胺的奶粉後，嬰幼兒產生了腎結石病症，呈現出病態的“大頭寶寶”現象。
三聚氰胺本身毒性較小，1994年國際化學品安全規劃署和歐洲聯盟委員會合編的《國際化學品安全手冊》第三卷和國際化學品安全卡片說明：長期或反複大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產生影響，導致產生結石。所以如何有效檢驗出奶製品是否含有三聚氰胺十分關鍵。
本實驗采用高效液相色譜儀，以乙腈和緩衝液作為流動相，三氯乙酸提取樣品，吹幹後用流動相溶解並定容、進樣，用紫外檢測器檢測。
三、儀器與試劑
1. 儀器
安捷倫高效液相色譜儀(配DAD檢測器)；電子天平（感量0.0001g)；超聲波清洗機；微型渦旋混合儀；高速離心機；氮氣吹幹儀；具塞塑料離心管；微孔濾膜：0.45μm；萃取小柱supelco C18固相萃取小柱，Polymer SCX Box，50x 3mL tubes，60mg(Agilent Technologies)；陽離子交換固相萃取柱(混合型陽離子交換固相萃取柱，基質為苯磺酸化的聚苯乙烯—二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL。 使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化)；C18柱；定性濾紙。
3. 試劑
三聚氰胺(化學純，98.5%)；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；氨水：含量為25%～28%；三氯乙酸；檸檬酸；辛烷磺酸鈉：色譜純；水：二次蒸餾水。
甲醇水溶液：準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻後備用；
三氯乙酸溶液(1%)：準確稱取10g三氯乙酸於1L容量瓶中，用水溶解並定容至刻度，混勻後備用；
氨化甲醇溶液(5%)：準確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻後備用；
離子對試劑緩衝液：準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，調節pH至3.50後，定容至1L備用。
3. 色譜條件
C18柱(5μm，150mm×4.6mm)；流動相：乙腈+緩衝溶液(15+85)；流速：1.0mL\/min；進樣量：20μl；檢測波長：240nm。
四、實驗步驟
1. 標準儲備液的配製
分別稱取三聚氰胺0.1004g，用流動相配製，定容於100mL容量瓶，配成100μg\/mL標準儲備液。
2. 配製係列標準溶液
將標準儲備液用流動相逐級稀釋至0.05μg\/mL、0.10μg\/mL、0.25μg\/mL、0.50μg\/mL、1.00μg\/mL、5.00μg\/mL、10.00μg\/mL、50.0μg\/mL的係列標準溶液。
3. 樣品前處理
3.1提取
稱取奶粉樣品0.5000g，加入4.5mL1%三氯乙酸提取液和1mL的乙腈，充分混勻，超聲10min，經微型渦旋儀5min。然後將溶液轉移至10mL離心管中，用8000rpm\/min離心20min，上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾後，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻後做待淨化液。
3.2淨化(SCX小柱，60mg\/3mL)
(1) 活化及平衡：3mL甲醇，5mL水；
(2) 上樣：加入提取液10mL；
(3) 淋洗：3mL水，3mL甲醇，棄去淋洗液並將小柱抽幹；
(4) 洗脫：6mL 5%氨化甲醇(v\/v)洗脫；
(5) 濃縮：50℃，氮氣吹幹，用流動相定容至1mL，HPLC分析。
4. 加標回收率實驗
采用加標測定回收率。取3種空白樣品各3份，分別加入一定量的混合標準使用液。經過同樣的樣品前處理及分析步驟，得到加標奶粉色譜圖。
5. 檢出限實驗
以基線噪聲三倍峰麵積對應的三聚氰胺最低檢測限為檢出限。
五、數據記錄與處理
1. 標準曲線的繪製
表58
濃度
(μg\/mL)0.050.100.250.501.005.0010.0050.0
峰麵積
以峰麵積對濃度(μg\/mL)作標準曲線。
2. 含量計算：根據標準曲線計算加標回收率
表59三聚氰胺的回收率
樣品添加量(mg)實測值(mg)回收率(%)平均回收率(%)
奶粉
0.1000
0.0500
0.0250
3. 檢出限：三聚氰胺的檢出限為多少。
4. 判斷含量是否合格。
六、注意事項
1. C18柱與Polymer SCX柱對三聚氰胺的前處理，發現C18對樣品的保留作用效果十分差。經其處理的含三聚氰胺的樣品，同比過Polymer SCX柱的信號，弱了很多。所以選擇了Polymer SCX柱來做前處理。
2. 流動相是色譜分離中十分重要的影響因素，直接關係分析的靈敏度、檢出限，決定著能否將樣品的組分洗脫分離。在緩衝液(pH=3.50)與乙腈比例為(85∶15)時分離效果好，且峰型對稱，出峰時間比較理想。所以離子對試劑緩衝液選擇PH=3.5，與乙腈的比例為85∶15。
七、思考題
1. 三聚氰胺是重要的氮雜環有機化工原料，主要用途是與醛縮合，生成三聚氰胺甲醛樹脂，生產塑料部分亞洲國家也用來製造化肥。那麼三聚氰胺為何會出現在食品當中呢？
2. 除了高效液相色譜法，三聚氰胺還有哪些檢測方法？
實驗五分散液液微萃取氣相色譜法測定
食品中的防腐劑含量
一、目的和要求
1. 理解氣相色譜分析中對測試溶液的要求。
2. 掌握分散液液微萃取氣相色譜法測定食品中山梨酸和苯甲酸的原理和方法。
3. 掌握實際樣品加標回收率實驗方法。
二、實驗原理
利用分散液液微萃取法提取液體食品中的山梨酸和苯甲酸，以弱極性柱分離山梨酸和苯甲酸，FID為檢測器，利用保留時間定性，直接比較法確定樣品中所含防腐劑，並確定防腐劑含量。