多級萃取又稱錯流萃取。該方法是將水相固定，用新鮮的有機相進行多次萃取，可提高分離效果。多級萃取適用於水相中隻含有一種被萃物的實驗，方法簡單，總萃取率高，但是有機相使用多會增加成本和工作量。
3. 連續萃取
此方法中溶劑得到了循環利用，提高了總萃取率。
4. 分層
萃取中的分層是指萃取後讓溶液靜置，待分層後再將兩相分開。如果在兩相界麵上出現沉澱或形成乳濁液，一般應增大萃取劑的用量，加入鹽析劑或者改變酸度等方法消除。
5. 洗滌
洗滌可以除去有機相中的雜質，洗滌液的組成和樣品提取液的組成相同但不含試樣，洗滌方式與萃取操作相同，通常洗滌1~2次即可。
四、超聲波和微波輔助萃取法
1. 超聲波萃取
超聲波是指頻率在20千赫到50兆赫的電磁波。超聲波萃取（Ultrasound Extraction， UE），也叫超聲波輔助萃取、超聲波提取，是利用超聲波輻射壓強產生的強烈空化效應、擾動效應、高加速度、擊碎和攪拌作用等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，增大樣品和萃取溶劑之間的接觸麵積，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行。超聲波萃取技術與常規的萃取技術相比，具有快速、價廉、高效等顯著優勢。早在20世紀50年代，超聲波萃取技術就得到了廣泛的應用，是一個非常成熟的技術。目前在食品安全領域特別是農藥殘留、食品中痕量有毒害物質的提取檢測中發揮了很好的作用。
超聲波萃取對溶劑和目標萃取物的性質要求不高，可供選擇的萃取溶劑種類多，目標萃取物範圍廣。目前，實驗室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產生的超聲波通過介質（通常是水）傳遞並作用於樣品，屬於間接作用方式，如果實驗室用的超聲波頻率較大會產生一定噪聲。
2. 微波輔助萃取
微波是指頻率在300 MHz至300 GHz的電磁波。微波輔助萃取（MicrowaveAssisted Extraction， MAE）是20世紀80年代由匈牙利學者Ganzler等提出的。該技術最早是作為一種樣品製備技術用於從土壤、種子、食品和飼料中分離各種類型化合物，之後由於其具有萃取時間短、選擇性好、萃取劑用量少、回收率高、重現性好等眾多優點而得到了廣大分析工作者的認同和關注。目前MAE作為一種新穎的樣品前處理技術廣泛用於多種食品汙染物的檢測中。
微波輔助萃取是利用微波能加熱來提高萃取效率的一種新技術，與傳統的熱傳導、熱傳遞加熱方式不同，它是通過偶極子旋轉和離子傳導兩種方式裏外同時加熱，無溫度梯度，因此熱效率高、升溫快速均勻，大大縮短了萃取時間，提高了萃取效率。在微波場中，不同物質對微波能的吸收程度不同，這樣就使得基體物質的某些區域或萃取體係中的某些組分被選擇性加熱，從而呈現出較好的選擇性。
現在實驗室常用的微波輔助萃取裝置根據萃取罐的類型可分為兩大類：密閉式和開罐式聚焦微波輔助萃取裝置，工作頻率均為2450MHz。
密閉式微波輔助萃取裝置的爐腔中可容多個密閉萃取罐，備有自動調節溫度和壓力的裝置，可實現溫壓可控萃取。該係統的優點是一次可製備多個樣品、易於控製萃取條件，且可在比溶劑沸點高得多的溫度下進行，因此更加有利於被分析組分從基體中迅速萃取出來，不易損失。開罐式聚焦微波輔助萃取裝置的萃取罐與大氣相通，隻能實現溫度控製，不能控製壓力。與密閉式相比，該裝置由於在常壓下使用操作更加安全，製樣量大，但一次不能萃取多個樣品。
第二節固相萃取
固相萃取（solid phase extraction， SPE）是一種基於液固色譜理論，通過固定相對樣品中目標組分或雜質進行選擇性吸附，實現目標組分與樣品基體和幹擾組分的分離或富集的一種樣品前處理方法。SPE適用於氣態及液態樣品前處理，對於固態樣品，必須將其轉化為液態之後才能進行固相萃取。SPE技術自20世紀70年代後期問世以來，發展迅速，廣泛應用於環境、製藥、臨床醫學、食品等領域。根據固相萃取的目的，SPE分為兩種模式。一種是目標化合物吸附模式固相萃取，即SPE柱主要用於吸附目標化合物。另外一種是雜質吸附模式固相萃取，即SPE柱主要用於吸附樣品中的雜質。
一、固相萃取與高效液相色譜的比較
固相色譜技術的發展在很大程度上得益於高效液相色譜（HPLC）填料技術的發展。因此，固相萃取技術與高效液相色譜技術有很多相似之處。兩者都是通過液體中的目標化合物在固體填料中的吸附和脫附達到分離的目的。
但是兩者也有很多區別之處，如兩者的目的不同。在分析型HPLC中，希望盡可能在短的時間內將混合物中的各組分分開實現待測組分的定性分析和定量分析，而固相萃取的目的是將目標化合物從複雜的樣品基質中分離出來，將幹擾組分盡可能去除，將目標化合物進行濃縮，以便更好地利用後續的分析儀器進行有效的定性、定量分析等。由於SPE與HPLC的目的不同，洗脫方式、柱的構成等也有所不同。HPLC中，樣品瞬間進入色譜柱，並在柱頭聚集，然後在固定相的作用下不斷地進行吸附—脫附，直至流出色譜柱。而在SPE中，化合物在SPE上的行為屬於前沿色譜，或稱開關色譜。樣品不斷流進SPE柱，化合物被吸附。在這個過程中沒有流動相或者說樣品基質就是流動相。在洗脫時，目標化合物隨洗脫溶劑流出SPE柱。表21給出了SPE與HPLC的比較。
表21SPE和HPLC的區別和對比
HPLCSPE
目的定性\/定量分析樣品萃取\/淨化\/濃縮
洗脫方式連續洗脫“數字式”開關洗脫
柱材料不鏽鋼柱塑料柱或玻璃柱
(續表)
HPLCSPE
填料粒度(mm)3～540～50
顆粒形狀規則球形不規則
塔板數20～25000<100
操作成本中至高低
設備成本高低
分離模式多種多種
壓力高壓低壓
操作可重複使用一次性
二、固相萃取原理
SPE的分離機製與HPLC基本相同，根據使用的固定相種類不同，即保留機製不同，其分離模式分為反相、正相、離子交換和混合模式。SPE分離模式主要取決於固定相的種類和溶劑的性質。
1. 反相固相萃取
反相SPE采用非極性或弱極性固定相，而樣品溶液或洗脫溶劑的極性比固定相極性大。反相SPE的保留機製是固定相中的非極性或弱極性基團與目標分子中的非極性基團之間的相互作用力，即色散力。使用最多的非極性SPE柱就是C18柱。C18柱使用的固定相為鍵合了十八個碳的直鏈烷烴官能團矽膠。常見的非極性鍵合矽膠固定相還包括C8,C6,C4,C2,CH(環己基)，PH(苯基)等。通常非極性的反相SPE柱較為適合從極性基質中萃取分離非極性及中等極性的目標化合物。對於吸附在反相固相萃取柱上的目標化合物，可以使用具有極性較小的溶劑洗脫，如氯仿、環己烷、乙酸乙酯等。隻要溶劑的洗脫強度足夠破壞目標化合物與固定相非極性官能團之間的範德華引力，就可以將目標化合物從SPE柱上洗脫下來。
2. 正相固相萃取
正相固相萃取采用極性固定相，固定相的極性比樣品溶液或洗脫溶劑的極性大。正相固相萃取的機製是利用目標化合物的極性官能團與固定相表麵的極性官能團相互作用，其中包括了氫鍵，ππ鍵相互作用，偶極偶極相互作用和偶極誘導偶極相互作用等。極性作用力的強度比非極性作用力大，比離子作用力小。在正相萃取的時候要避免用水，水會在正相萃取材料的活性位置被牢固地吸附，使得目標化合物不能被很好地吸附。正相固相萃取適合從非極性樣品溶液中萃取極性成分，一般用於有機萃取液的淨化，將極性幹擾組分保留在固定相上，而非極性目標組分流出用於進一步的富集或分析。在食品分析中正相萃取經常作為一種淨化手段來使用，可以除去萃取液中的極性雜質。
3. 離子交換固相萃取
離子交換固相萃取是基於目標化合物與固定相之間的靜電吸引力，萃取帶有相反電荷的離子。離子作用力的強度在三種作用力中最強，選擇性也最好。適用於從水溶液中萃取能夠生成陽離子或陰離子的有機化合物，對溶液進行除鹽，從樣品中除去離子化的幹擾物等。離子交換固相萃取使用的填料按照鍵合的離子基團的性質可分為陽離子和陰離子交換固定相。在離子交換固相萃取模式中特別要注意調節樣品溶液的酸度，該酸度直接影響到固定相離子基團所帶電荷和目標化合物所帶電荷，從而影響萃取或淨化效果。
4. 混合模式固相萃取
同時利用固定相上的兩個或兩個以上官能團的分離機製成為混合模式。例如，固定相同時包含非極性官能團和離子交換基團就可以實現反相和離子交換。這種模式利用不同的官能團通過調節pH，可以同時除去無機離子和非極性化合物的幹擾。
固相萃取中固定相的選擇可參考圖21。
圖21固相萃取中固定相選擇一般原則
三、SPE的優點
(1) 簡單、快速和簡化了樣品預處理操作步驟,縮短了預處理時間。
(2) 處理過的樣品易於貯藏、運輸，便於實驗室間進行質控。
(3) 可選擇不同類型的吸附劑和有機溶劑用以處理各種不同類的有機汙染物。
(4) 不出現乳化現象,提高了分離效率。
(5) 僅用少量的有機溶劑,降低了成本，減少了環境汙染。
(6) 易於與其他儀器聯用,實現自動化在線分析。
四、SPE的基本模式
根據固相萃取使用的目的不同，常見的固相萃取模式主要有兩種，其步驟視萃取機理及檢測手段可多可少。第一種模式為目標化合物的吸附模式，又稱經典固相萃取模式。該模式是通過SPE柱對目標化合物進行吸附，然後洗脫。第二種模式是幹擾物吸附模式，也稱雜質吸附模式或除雜模式。此種模式中，SPE柱對雜質進行吸附，目標化合物在SPE柱上不保留。對於一些基質比較複雜的樣品，可將兩種模式結合使用，即雙柱萃取模式。
1. 目標化合物吸附模式（常用模式）
目標化合物吸附模式是固相萃取最常使用的一種模式，通常可以分為5個步驟。
（1） 柱的活化預處理
為了得到高回收率和良好重現性，萃取之前要用適當的溶劑淋洗小柱，以使吸附劑保持濕潤，增加對目標化合物的吸附性。如果是反相填料，一般用極性有機溶劑淋洗，如甲醇或者極性弱一些的乙腈、丙酮等衝洗填料。如果是正相填料，用非極性溶劑衝洗填料，如果是離子交換填料，用去離子水或低離子強度緩衝液(0.001mol\/L～0.010mol\/L)衝洗填料。
（2） 上樣（過柱）
樣品過柱的主要目的是要將樣品中的目標化合物定量地保存在SPE柱上，使其與未被保留的樣品基質及幹擾物分離。一般是將樣品溶液添加至SPE柱中，利用正壓、負壓或者重力作用，使樣品通過SPE柱。過柱的流速一定要控製，根據需要分離的目標產物選擇合適的流速。流速慢有利於目標化合物的吸附，但也增加了雜質吸附的機會，並且增加萃取的時間。
（3） 固相萃取柱幹燥
如果最後的洗脫劑為緩衝溶液或水溶性有機溶劑，而且分析手段為反相液相色譜，萃取柱上的殘留水分對目標化合物的洗脫與分析影響不大，可以省略柱幹燥步驟。但是如果使用水溶性差的有機溶劑為洗脫劑或分析手段為GC或GCMS時，萃取柱就需要幹燥。
（4） 洗滌
在樣品進入吸附劑、目標化合物被吸附後，用適當的洗滌劑洗掉吸附力弱的幹擾化合物，而目標化合物依然保留在柱上。洗滌劑的選擇取決於雜質的性質及最後的分析手段。不同的檢測手段對於樣品的“幹淨”程度的要求不同。
（5） 洗脫
利用合適的溶劑將目標化合物從SPE柱上洗脫下來並收集，用於後續的檢測。選用的洗脫劑對目標化合物要有足夠的洗脫強度和選擇性並盡可能與分析檢測儀器相適應。同時洗脫過程中也要注意控製洗脫劑的流速。
固相萃取柱預處理
樣品過柱（棄去過柱液體）
固相萃取柱洗滌（棄去過柱液體）
固相萃取柱幹燥
目標物洗脫（收集洗脫溶液）
圖22SPE目標化合物吸附模式步驟圖
2. 幹擾物吸附模式（淨化模式）
雜質吸附模式的目的是除去樣品中的雜質，在這種萃取模式中，目標化合物仍保留在樣品基質中，而雜質被SPE小柱保留。這種模式分為3個步驟。如圖23所示。
固相萃取柱預處理
樣品過柱（收集過柱液體）
固相萃取柱洗滌（收集洗滌液體）
圖23雜質吸附模式固相萃取步驟圖
（1） 柱的活化預處理
柱的活化預處理和目標化合物吸附模式的處理方法相同。
（2） 上樣（過柱）
在此模式中雜質被吸附而目標化合物沒有被吸附，樣品基質直接通過SPE柱。
（3） 洗滌
利用合適的洗滌劑將殘留在SPE柱上的目標化合物洗滌下來。
3. 多維萃取模式
在一些基質比較複雜的樣品分析如食品分析中，除了采用單一的模式，還可以將兩種模式結合起來使用，達到更好的萃取分離效果。
五、固相萃取的操作模式
固相萃取中樣品溶液可以通過不同的方式流過萃取小柱，可以手動進行也可以自動完成，下麵主要介紹手工固相萃取的幾種操作模式。
1. 重力操作模式
樣品溶液倒入小柱上，不施加任何外力，隻通過重力作用，流過SPE柱。該種方式速度比較慢，但是可以延長液體與目標化合物的作用時間，因此通常在對目標化合物洗脫時使用，可以得到較好的回收率。
2. 手工加壓模式
可以通過注射器或者連接氣體的橡皮管產生正壓，使流體通過SPE柱。如圖24所示。這種加壓方式比重力方式速度要快，但是也難以控製液體通過SPE柱的流速。
1注射器，2管接口，3，5樣品溶液，4空氣或氮氣入口
圖24手工加壓示意圖
3. 負壓操作模式
通過負壓固相萃取裝置使液體流過SPE柱。將固相萃取小柱連接針頭與抽濾瓶橡膠塞相連抽真空，使液體流過SPE柱。在雜質吸附模式中，流出液可以棄去，在目標化合物吸附模式中，洗脫液接收在幹淨的試管中。
1樣品溶液，2橡膠塞，3接真空，4收樣試管
圖25負壓固相萃取示意圖
4. 正壓操作模式
通過正壓氣體固相萃取裝置使液體流過SPE柱。該種裝置配有流量調節閥可以精確地控製液體流速，提高固相萃取的重現性。
圖26正壓萃取裝置
第三節固相微萃取
常規的SPE雖然操作簡單、價格便宜，使用的溶劑量較少，但也存在回收率偏低，樣品SPE柱容易堵塞、隻能一次性使用，不同批次的小柱萃取的重現性差，隻適合沸點高於洗脫溶劑沸點的半揮發物質等不足。
固相微萃取（solid phase microextraction， SPME）技術可以克服SPE的上述缺點，更加適合實驗室和現場樣品的快速前處理，且同時具有操作簡單、攜帶方便、環保、操作費用低廉等優點。SPME經過20多年的發展，已成功地和各種儀器分析方法相結合，成為各個領域應用極為廣泛的綠色樣品製備技術。
一、SPME的原理
SPME以熔融石英光導纖維或其他材料為基體支持物，在其表麵塗漬不同性質的高分子固定相薄層，通過直接或頂空方式，利用“相似相溶”的原理，目標化合物在樣品基體和纖維塗層之間進行分配，對目標化合物進行提取、富集後將富集了待測物的纖維直接轉移到儀器（一般是GC，或HPLC）中，通過一定的方式解吸附（一般是熱解吸，或溶劑解吸），然後進行分離分析。
固相微萃取法（SPME）的原理與固相萃取不同，固相微萃取不是將待測物全部萃取出來，其原理是建立在待測物在固定相和水相之間達成的平衡分配基礎上。
設固定相所吸附的待測物的量為WS，因待測物總量在萃取前後不變，固得到：
C0·V2=C1·V1+C2·V2（1）
式中，C0是待測物在水樣中的原始濃度；C1、C2分別為待測物達到平衡後在固定相和水相中的濃度；V1、V2分別為固定相液膜和水樣的體積。
吸附達到平衡時，待測物在固定相與水樣間的分配係數K有如下關係：
K=C1\/C2（2）
平衡時固相吸附待測物的量WS=C1·V1，故C1=WS\/V1
由式（1）得：C2=(C0·V2－C1·V1）\/V2
將C1、C2代入式（2）並整理後得：
K=WS·V2\/[V1·（C0·V2－C1·V1)]
=WS·V2\/（C0·V2·V1－C1V21）（3）
由於V1V2，式3中C1·V12可忽略，整理後得：
WS=K·C0·V1（4）
由式（4）：WS=K·C0·V1，可知WS與C0呈線性關係，並與K和V1呈正比。決定K值的主要因素是萃取頭固定相的類型，因此，對某一種或某一類化合物來說選擇一個特異的萃取固定相十分重要。萃取頭固定液膜越厚，WS越大。由於萃取物全部進入色譜柱，一個微小的固定液體積即可滿足分析要求。通常液膜厚度為5~100μm。
二、SPME裝置
圖27商品化的SPME裝置圖（Supelco）
商品化的SPME裝置類似微量注射器，由手柄和萃取頭（纖維頭）兩部分組成。萃取頭是一根長約1cm、塗有不同固定相塗層的熔融石英纖維，石英纖維一端連接不鏽鋼內芯，外套細的不鏽鋼針管（以保護石英纖維不被折斷）。手柄用於安裝和固定萃取頭，通過手柄的推動，萃取頭可以伸出不鏽鋼管。
三、固相微萃取一般步驟
SPME方法是通過萃取頭上的固定相塗層對樣品中的待測物進行萃取和預富集。SPME操作主要包括三步：（1） 將塗有固定相的萃取頭插入樣品或位於樣品上方；（2） 待測物在固定相塗層與樣品間進行分配直至平衡後，將萃取頭插入分析儀器（一般為氣相色譜儀）的進樣口；（3） 通過一定的方式解析後進行分離分析。以氣相色譜為檢測手段的手動固相微萃取裝置操作具體步驟圖28。
1將進樣針頭插入樣品小瓶；2用推杆將萃取頭推出，進入溶液（萃取過程）；
3將進樣針從樣品溶液中取出，並將萃取纖維拉回進樣針頭；4用進樣針刺穿氣相色譜進樣隔墊進入汽化室；
5將萃取石英纖維推出，暴露在汽化室（解析）；6將萃取石英纖維退回進樣針並把進樣針拔出
圖28固相微萃取實驗步驟示意圖
四、固相微萃取的操作模式
1. 直接萃取法
直接萃取法(如圖29A)中將萃取頭直接伸入樣品溶液，適用於氣體基質或幹淨的水基質中。
2. 頂空萃取法
在頂空萃取模式中(如圖29B)，目標分析物通過空氣層到達萃取頭的塗層，可以保護塗層不被高分子或溶液中其他不揮發物質汙染。適用於任何基質，尤其是直接SPME無法處理的髒水、油脂、血液、汙泥、土壤等。
3. 膜保護法萃取
膜保護法萃取（如圖29C）是通過一個選擇性的高分子材料膜將試樣與萃取頭分離，以實現間接萃取，膜的作用是保護萃取頭使其不被基質汙染，同時提高萃取的選擇性。
4. 衍生化萃取
塗層在萃取強極性或者離子型目標產物時，為了提高萃取的選擇性和萃取量，通常會加入衍生化的步驟，使目標分析物轉變成易於萃取的低極性物質。
圖29固相微萃取操作模式
五、固相微萃取固定相形式
固相微萃取中固定相使用形式多樣，具體如圖210所示。最常用的是將固定相塗敷在融凝石英纖維上，這種方式非常適合固相微萃取和氣相色譜聯用技術。
A. 纖維固相微萃取；B. 管內固相微萃取；C. 薄膜固相微萃取；
D. 磁性粒子固相微萃取；E. 管尖內固相微萃取；F. 攪拌棒固相微萃取.
圖210固相微萃取固定相使用方式示意圖
六、SPME的影響因素
1. 塗層的選擇
SPME萃取過程依賴於目標分析物在塗層和樣品兩相中的分配係數，因此萃取的選擇性取決於塗層材料的特性，塗層材料是SPME技術的核心。
塗層的選擇和設計可以基於色譜經驗，一般來說，不同種類的分析物要選擇不同性質的塗層材料，選擇的基本原則是“相似相溶”。選擇塗層時應注意：塗層必須對目標分子有較強的萃取富集能力，本身有合適的分子結構，有較快的擴散速度以及良好的熱穩定性。同時塗層的厚度也要適宜，塗層的厚度會影響方法的靈敏度。
2. 萃取溫度
萃取溫度是直接影響分配係數的重要參數，升高溫度會促進揮發性化合物到達頂空及萃取纖維表麵，然而SPME表麵吸附過程一般為放熱反應，低溫適合於反應進行。
3. 萃取時間
不同的待測物達到動態平衡的時間長短,取決於物質的傳遞速率和待測物本身的性質、萃取纖維的種類等因素。揮發性強的化合物在較短時間內即可達到分配平衡，而揮發性弱的待測物質則需要相對較長的平衡時間。
4. 攪拌時間
磁力攪拌、高速勻漿、超聲波等都可以增加傳質速率，提高吸附萃取速度，縮短達到平衡的時間。采取超聲振動比電磁攪拌達到平衡的時間會大大縮短。
5. 鹽效應
鹽析手段可提高本體溶液的離子強度，使極性有機待萃物(非離子)在吸附塗層中的K值增加，提高萃取靈敏度。
6. 溶液pH值
對不同酸離解常數的有機弱酸堿選擇性萃取。溶液酸度應該使待萃物呈非聚合單分子遊離態，使塗層與本體溶液爭奪待萃物的平衡過程極大地偏向吸附塗層。
7. 衍生化
對於酚類和脂肪酸等極性較強的化合物可以通過酯化的方法降低其極性，提高揮發性，增強被固定相吸附的能力。
8. 萃取頭的選擇
可選擇固定液塗漬在一根熔融石英（或其他材料）細絲表麵構成的萃取頭，也可以選擇內部塗有固定相的細管或毛細管做管內SPME。
第四節分散液液微萃取
分散液液微萃取（Dispersive liquidliquid microextraction， DLLME）是Rezaee等於2006年提出的一種能夠實現快速萃取富集的新型液相微萃取技術，相當於微型化的液液萃取。DLLME是基於分析物在小體積萃取劑和樣品溶液之間分配平衡的過程，其原理是萃取劑在分散劑作用下於樣品溶液中形成分散的細小液滴，形成萃取劑分散劑樣品溶液三相乳濁液體係，從而增大了萃取劑和分析物的接觸麵積，使分析物在樣品溶液及萃取劑之間快速達到分配平衡而完成萃取。
DLLME的萃取過程如圖211所示，它利用能溶於水的分散劑，使不溶於水的萃取劑在水樣中形成較為均勻的乳濁液，再通過離心的方法使得含有目標分析物的萃取劑沉積在錐形離心管底部，最後吸取沉積在底部的萃取劑，進樣測量。該方法增大了萃取劑與目標分析物之間的接觸麵積，使萃取能夠迅速完成，操作簡單快速，使用的有機溶劑非常少因而對環境友好，是一種綠色環保的食品分析樣品前處理方法。
圖211DLLME過程示意圖
自被報道以來，DLLME已發展出許多操作模式，其應用也越來越廣泛。近年來重要的研究成果集中於該技術在不同基質樣品中的應用、在不同分析物中應用的拓展、低毒萃取劑的篩選、操作模式的創新發展以及該技術與其他樣品前處理技術的聯用。該方法適用的樣品主要有飲用水、環境水、血液、尿液和飲料等液體樣品，以及土壤、水果、蔬菜、糧食、藥物和包裝材料等固體樣品，分析物主要包括有機汙染物、農藥殘留、環境激素殘留、藥物有效成分分析等。
為了取得良好的萃取效果，需要優化分散液液微萃取的條件，影響分散液液微萃取效果的因素有：萃取劑的種類和體積、分散劑的種類和體積、樣品溶液的pH值、樣品溶液的離子強度、萃取時間、萃取方式等。
在DLLME過程中，萃取劑性質是影響萃取率的重要因素之一。萃取劑一般需要滿足以下條件：① 對分析物溶解度高，樣品溶解度低；② 不幹擾目標分析物出峰；③ 萃取離心後易與樣品溶液分離。傳統的DLLME，常采用鹵代烴（氯苯、氯仿、四氯化碳、四氯乙烯等）作為萃取劑，但這類萃取劑一般毒性較大，有些甚至致癌。為了克服這些缺點，並拓寬DLLME萃取劑的選擇範圍，近年來，有研究者嚐試采用正辛醇、十二醇等低毒或者無毒的低密度試劑作為萃取劑，產生了一類新的DLLME模式——低密度萃取劑分散液液微萃取（LDSDLLME），通過一些特殊的裝置，已成功建立了多種物質的LDSDLLME分析方法。懸浮固化分散液液微萃取（DLLMESFO）是一類改進的LDSDLLME，該技術選用密度小於水、熔點接近室溫(10～30℃)的有機溶劑作為萃取劑，萃取完成後，懸浮於樣品溶液表麵的萃取劑經冰浴冷卻固化後取出，室溫下融化進樣分析。萃取劑體積直接影響萃取率和富集倍數。增大萃取劑體積可提高萃取率，而富集倍數和靈敏度則會降低。減少萃取劑體積可提高富集倍數及靈敏度，但其萃取率會降低，重現性也可能會變差。此外，萃取劑體積需保證足夠用於上機分析。因此，萃取劑體積選擇的基本原則是在兼顧各方麵因素的前提下盡可能減少萃取劑用量，通常選擇萃取劑體積為10~100μL。
分散劑也是影響萃取率的另一重要因素，分散劑一般需在萃取劑和樣品溶液中都具有良好的溶解性，以使萃取劑呈微小的液滴均勻分散在樣品溶液中，從而增大萃取劑與分析物的接觸麵積，提高萃取率。常用的分散劑有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。這些分散劑用量大，易揮發，對環境易造成汙染。為了減少有機溶劑的使用，發展更為綠色的微萃取技術，相繼出現了一些新的分散模式，比如表麵活性劑輔助分散液液微萃取(SADLLME)法、超聲輔助乳化微萃取法(USAEME)、磁力攪拌輔助分散液液微萃取、空氣輔助液液微萃取(AALLME)等技術。這些技術均不同程度減少了有機溶劑的用量，將是液相微萃取發展的一個重要方向。傳統DLLME中，分散劑體積直接影響三相乳濁液體係的形成，從而影響萃取率。分散劑較少時，萃取劑分散不均勻，不能形成很好的乳濁液體係，萃取率低；分散劑過多時，分析物在樣品溶液中的溶解度增大而不易被萃取，萃取率也會降低。因此，整個萃取過程需要選擇合適的分散劑用量，一般分散劑體積為0.5～1.5mL。
對於有機弱酸或弱堿組分，樣品溶液的pH對其萃取效率影響很大。因為改變酸堿樣品溶液的pH，可以改變酸性或堿性分析物的狀態，使其處於分子或離子狀態，從而影響萃取率。如對於含酸性基團的目標分析物，當樣品溶液pH＜pKa時，目標分析物電離平衡會向中性分子方向移動，此時，分子態的分析物更容易轉移到萃取劑相中。因此，pH越低，分子化目標分析物越多，越容易萃取到萃取劑中，其萃取率越高。但pH過低時，鹽溶效應的影響也會使其萃取率降低，因此，選擇合適的樣品溶液pH對DLLME操作很重要。
樣品溶液的離子強度對萃取率的影響是雙向的。一方麵增加離子強度，鹽析效應會使有機萃取劑和分析物在水相樣品溶液中的溶解度降低，萃取率提高；另一方麵，離子強度過強也可能引起鹽離子在萃取劑中產生靜電效應而阻止分析物進入萃取劑中，從而使萃取率降低。因此在DLLME需要優化樣品中離子強度。
在DLLME中分散劑的作用下，萃取劑能夠以細小液滴均勻分散在樣品溶液中，極大增加分析物與萃取劑的接觸麵積，傳質速度加快，在很短時間內即可達到萃取平衡，一般萃取時間均不超過5min。
DLLME在食品領域中的分析物主要有農藥、生物毒素、食品添加劑、環境雌激素等，分析樣品包括果汁飲料、牛奶、蜂蜜、蔬菜、水果、穀物、食用油、豬肉等。食品分析麵臨分析物濃度低、基質幹擾物多且組成複雜等問題，而傳統的樣品前處理方法由於操作煩瑣耗時、有機溶劑用量大、靈敏度低等已不能滿足現代分析化學發展的需要，因此，發展快速、高效、環境友好的新型樣品製備技術顯得非常有意義。分散液液微萃取技術因操作簡單、靈活省時、高效精確、環境友好等特點，並通過操作模式不斷地發展及與多種新型樣品前處理方法的聯用，在食品分析領域中展現出愈來愈廣闊的應用前景。
第五節離子液體萃取
離子液體(Ionic liquids， ILS)指在室溫及鄰近室溫下，完全由大的有機陽離子和小的陰離子組成的呈液態的有機熔鹽體係。組成離子液體的陽離子通常為有機陽離子（例如咪唑陽離子、吡啶陽離子、季銨陽離子等），而陰離子可為無機陰離子或有機陰離子（如［PF6］－、［BF4］－、［AlCl4］－、CF3COO-等）。
近年來,離子液體已經在萃取分離、催化、材料、生物質能源、環境、電化學、石油化工等諸多領域展現了良好的應用前景。
一、離子液體的特性
1. 可設計性
離子液體的性質可以通過陰陽離子結構的改變進行調節，是一類“可設計溶劑”。通過對離子液體的陰陽離子的設計可調節其對無機物、水、有機物、聚合物等的溶解性，精細調控離子液體與研究分子的相互作用方式及強度，實現化合物結構微小差異的分子識別。
2. 獨特的理化性質
（1） 熔點低，通常在0～100℃，主要受離子液體的陰、陽離子種類和結構影響；
（2） 無色、無味、飽和蒸氣壓極低，不易揮發；
（3） 熱穩定性好，大部分離子液體能在250~350℃保持穩定，不易燃，其分解溫度通常在400℃；
（4） 溶解度好，溶解範圍廣，可溶解多種有機、無機及高分子材料，易形成液液兩相。
這些特性使離子液體在萃取分離方麵具有良好的效果，被認為是替代傳統有機溶劑的一種新型綠色溶劑。
二、離子液體萃取原理
離子液體是完全由陰、陽離子組成的離子型化合物，存在著特有的微觀靜電場和分子環境，在結構和性質上與傳統的分子溶劑存在明顯區別。離子液體結構中往往同時具有疏水、不飽和鍵、氫鍵供體、氫鍵受體、靜電等多種結構片段，因此離子液體可與溶質之間發生疏水、氫鍵、靜電、ππ等多種相互作用，使離子液體具有傳統分子溶劑不能比擬的優勢。
研究結果表明離子液體與溶質分子之間存在著多重溶劑化作用。離子液體與溶質之間的氫鍵酸堿相互作用在離子液體的應用中起重要的作用，對於很多化合物，氫鍵堿性的提高往往能夠提高溶解度或帶來較好的分離效率。氫鍵網絡結構的存在證明了離子液體並不是簡單的完全電離的離子體係。納米結構也是離子液體有別於傳統分子溶劑的一個重要特性，也是其得以成為兩親自組裝媒介的重要條件。
三、常見離子液體
由於離子液體的可設計性，其組成越來越多樣化。根據離子液體發現的年代先後順序可以將其分為三代：第一代主要是三氯化鋁和鹵化乙基吡啶離子液體，後來又相繼出現了烷基咪唑和烷基吡啶與其他金屬氯化物（如FeCl3、InCl3、GaCl3等）形成的離子液體。這類離子液體雖然存在性能優異、酸堿性可以任意調節、構成的陰離子價格低廉等優點，但是該類離子液體大多對水和空氣敏感，遇水甚至在空氣中易發生分解反應。第二代離子液體出現在20世紀90年代，陰離子是由四氟硼酸(BF-4)，六氟磷酸(PF-6)構成，陽離子則由二烷基咪唑組成。後來又相繼出現了雙三氟甲烷磺酰亞胺(NTf-2)、三氟甲磺酸(CF3SO-3）、二氰酰胺[(CN)2N-]等陰離子。這類離子液體穩定性更好，至今仍在被廣泛研究。第三代離子液體被稱為功能性離子液體，通過在其陰離子或陽離子的結構單元上引入氨基、氰基、醇基、羧基等官能團，使其既具有離子液體本身的性質又具有官能團的性質，在金屬萃取領域受到越來越多的關注。
有的離子液體可以溶於水，而有的離子液體則不溶於水，可根據情況選擇。由Cl-、BF-4、CF3SO-3等陰離子組成的離子液體有疏水性，由PF-6和（CF3SO2）N-等所組成的離子液體為疏水性離子液體。
四、離子液體萃取的應用
1. 離子液體對金屬離子的萃取
單獨使用離子液體作萃取劑時,通常依靠離子交換機製和離子對作用實現金屬離子萃取。但金屬離子在離子液體中的溶解度必定非常低,有研究表明，單純的離子液體[C6mim][PF6]對Zn2＋和Cu2＋的萃取率僅為3.5%和 0.5%，但通過添加NaCl可以顯著提高金屬離子的萃取率。
為了克服單獨離子液體使用的弊端,可選擇憎水性的離子液體作有機相，再添加對金屬離子有特殊作用的協萃劑（螯合劑）。一般協萃劑往往對金屬離子具有螯合（或配位）作用，例如，冠醚及其衍生物、雙硫腙鄰羧基苄基重氮氨基偶氮苯（簡稱CDAA）、1（2吡啶偶氮）2萘酚（簡稱PAN）等。協萃劑的加入，大大降低了金屬離子在水中的溶解度，有效提高金屬物質在離子液體中的分配係數D值。在考慮離子液體添加螯合劑構建複合萃取劑時必須考慮離子液體、螯合劑和金屬離子的匹配問題，最基本的要求是螯合劑必須隻能溶解於離子液體中。
2. 離子液體對天然活性物質的提取
植物在代謝過程中會產生各類由生物途徑合成的二次代謝產物，其中不少具有明顯的生理活性，因而被稱為生物活性物質。天然活性物質由於分子結構複雜、分子內聚能高、往往兼具多個官能團，因此在水和非極性溶劑中溶解度均十分有限；且各結構相似物間性質相近，分離純化難度很大。離子液體因其與天然活性分子之間的ππ、氫鍵、範德華力和靜電力等的多重相互作用，具有良好的溶解性、極高的分離效率、優異的選擇性等特點，表現出傳統方法不具備的優勢。離子液體的提取可以通過兩方麵實現。第一，離子液體通過與分子之間的作用力實現萃取；第二，某些離子液體可以溶解纖維素，而細胞壁的主要成分就是纖維素，這就使得要提取的物質穿過細胞壁得到釋放，從而得到很好地分離，提高了提取效率。離子液體的萃取方式有很多，主要有液液萃取、超高壓輔助提取、雙水相萃取、微波輔助萃取和超聲強化萃取。
3. 離子液體萃取和其他萃取技術的結合
離子液體可以和其他萃取技術相結合，如固相微萃取、中空纖維支撐膜萃取、液液分散微萃取、微波輔助萃取等。離子液體微萃取分離的主要流程如下：先對離子液體進行設計，然後將有機溶液放置於中空纖維內部，進行富集物質的測定和萃取分離。液相微萃取通常萃取要求萃取時間長、萃取方式萃取劑的種類多、粘度大並且不易揮發，離子液體剛好具備這些性能，因此其作用優勢明顯。
五、離子液體的回收
1. 常規的減壓蒸餾回收
離子液體減壓蒸餾法回收離子液體是目前最為常用的方法。由於離子液體的揮發性低，采用減壓蒸餾可將低沸點、熱穩定性好的組分除去，進而回收離子液體。此外，還可以采用分子蒸餾的方法從廢液中回收離子液體。
2. 液液萃取回收離子液體
當萃取組分為難揮發、熱敏性的組分時，可采用液液萃取回收離子液體。該方法通過加入與離子液體不互溶的有機溶劑(如乙醚、乙烷)或采用超臨界萃取等，從而達到回收離子液體的目的。
3. 雙水相技術回收離子液體
該方法通過無機鹽對離子液體的鹽析作用，使含水離子液體形成富含離子液體相和富含無機鹽的水相，進而回收離子液體。
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第三章食品快速檢測技術
第三章食品快速檢測技術
第一節膠體金免疫層析試紙條技術介紹
膠體金免疫層析試紙條是八十年代初發展起來，以膠體金作為示蹤標誌物應用於抗原抗體的快速免疫分析技術。膠體金顆粒表麵的負電荷與蛋白質等高分子的正電荷基團可以通過靜電吸附而牢固結合。
膠體金也稱金溶膠，是由金離子被還原劑還原後形成的膠態納米金懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核和包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表麵的是內層負離子（AuCl-2），外層雙層正離子層H+則分散在膠體溶液中，以維持膠體金遊離於溶膠間的懸液狀態，如圖31所示。金顆粒直徑多在1～100nm，呈紅色，在溶液中呈穩定、均勻的單一分散狀態。
圖31膠體金顆粒示意圖
膠體金免疫層析試紙條技術在食品安全快速檢測中應用十分廣泛，如工商部門現場監測執法，企業對采購的原料進行現場檢測並確定是否接收，或對生產過程中的質量控製等。免疫層析試紙條作為大量樣品現場快速初篩的方法，有著獨特的優勢。一般對於免疫層析試紙條法篩選出的陽性結果，後繼需要用HPLC等理化方法進一步地確認和定量。
一、膠體金免疫層析試紙條結構
膠體金免疫層析試紙條是由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊和PVC粘性底板等5部分組成，如圖32所示。
圖32膠體金免疫層析試紙條結構示意圖
1. 樣品墊
樣品墊一般有玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質、多種規格。樣品墊的主要作用是可以減緩樣品滲透速度，有利於樣品在結合墊上均勻分布，去除樣品中顆粒雜質，調節樣品液pH或粘度等。樣品墊可使用化學物質進行浸漬處理，從而減少樣品差異，提高試驗的靈敏度。通常可以將洗滌劑、粘度增強劑、阻滯劑及鹽滲入樣品墊然後加以幹燥，該工藝可避免使用複雜緩衝劑，使檢測一步完成。
2. 膠體金結合墊
膠體金結合墊和樣品墊一樣，一般也有玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規格。結合墊的主要作用是吸附一定量的金標抗體，保持金標抗體的穩定性，並保證金標抗體定量完成釋放。
3. 硝酸纖維素膜（NC膜）
硝酸纖維素膜一般使用Millipore，MDI，S&S，Whatman等國外公司的品牌。NC膜的作用是在檢測線和質控線條帶區域固定抗體，金標抗體和樣品在NC膜上流動並與試劑混合發生免疫反應，反應在NC膜上顯色，判斷檢測結果。NC膜的孔徑、對稱性、層析速度、表麵活性劑、蛋白結合力、強度、表麵質量、厚度、批間均一性等參數對檢測結果影響很大。一般層析速度越快，金標樣品和包被在檢測線上的抗體或抗原的反應時間也就越短，靈敏度會隨之降低。反之，層析速度越慢，反應時間越長，發生非特異性結合的可能性也就越大，也會降低靈敏度。因此，要選擇合適層析速度的NC膜來控製免疫反應的時間對於提高反應的靈敏度非常重要。
4. 吸收墊
吸收墊一般是提供高吸收率、高容量以及相對穩定吸收率的吸收紙。吸收墊的作用主要表現在控製樣品的流速，促進虹吸作用以實現試劑的流動。
5. PVC粘性底板
底板一般是不幹膠塑料襯底，其質量在很大程度上影響了產品的使用有效期。
二、膠體金免疫層析試紙條檢測原理
免疫層析試紙條是借助毛細作用，使樣品在條狀纖維製成的NC膜上泳動，其中的待測物與固定在膜上一定區域內的抗體相結合，通過膠體金顯色，短時間(5～15min)內便可得到直觀的結果。結合標記物與自由標記物通過免疫層析作用，實現自動分離，省去了煩瑣的加樣、洗滌等步驟，因而操作簡單、快速，操作人員無須專業培訓，且不需或僅需簡單的儀器。
膠體金免疫層析試紙條按照其檢測原理可以分為雙抗夾心免疫層析法和競爭免疫層析法。在食品安全檢測當中，檢測的對象都是些小分子化合物，其與抗體的結合位點較為單一。因此，一般采用競爭免疫層析法的原理來檢測。
1. 競爭免疫層析法原理
將金標抗體吸附於結合墊上，抗原偶聯物噴塗於T線，抗金標抗體噴塗於C線。待測樣品滴加到樣品墊上，通過毛細管作用，樣品液迅速通過結合墊，使其上的金標抗體溶解，並帶動金標抗體一起向前泳動。當金標抗體和樣品液到達T線時，如樣品液中含有待測抗原較多，則與T線處包被的抗原競爭結合金標抗體上的抗原結合位點，T線上捕獲的金標抗體較少，不顯色，C線顯色，為陽性結果。如樣品液含有的待測抗原較少，則T線上捕獲到的金標抗體較多，顯示紅色條帶，C線亦顯色，為陰性結果，如果質控線C線無色，說明試紙條無效。
圖33膠體金免疫層析試紙條競爭法原理
圖34競爭免疫層析法的結果判斷圖
2. 操作步驟
（1） 取待檢樣品，若樣品比較混濁時，可3000rpm離心5min後過濾。
（注：點樣前，應待樣品溫度恢複至室溫即20~25℃後，方可進行檢測！）
（2） 取出空白微孔，使用滴管或移液器吸取待檢樣品清液，加入6～7滴或250μL於空白微孔中。
（3） 取出所需量的試紙條，將試紙條有藍色膜條的一端向下插入微孔中，反應5～15min。或直接將待測樣品滴加到樣品墊上。
（注：取出試紙條後，立即將袋子封口，以防受潮。）
（4） 從微孔中取出試紙條，判定結果。
3. 結果判定
檢測結果可由金標閱讀儀根據內置的標準曲線計算結果，也可由肉眼直接判定。
陰性：C線顯色，T線肉眼可見，無論顏色深淺均判為陰性。
陽性：C線顯色，T線不顯色，判為陽性。
無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙條均判為無效。
第二節酶聯免疫檢測技術
ELISA是酶聯免疫吸附劑測定(EnzymeLinked Immunosorbnent Assay)的簡稱，它是繼放射免疫和熒光免疫技術之後發展起來的一種酶免疫技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用於食品安全檢測、生物學和醫學等眾多領域。
一、ELISA原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原、抗體的反應在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的遊離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種，即：用於檢測抗體的間接法、用於檢測抗原的雙抗體夾心法以及用於檢測小分子抗原或半抗原的競爭法等。在食品安全檢測中比較常用的是競爭法，原理示意圖如圖35所示。
圖35ELISA競爭法檢測原理示意圖
二、ELISA操作步驟
1. 包被
用0.05M pH=9.6碳酸鹽包被緩衝液將小分子人工抗原稀釋至含量為 1～10μg\/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加100μL，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鍾。（簡稱洗滌，下同）。
2. 封閉
每孔中加入100μL10mg\/mLBSA（牛血清白蛋白）於上述已包被的反應孔中，置室溫孵育1小時。然後洗滌。
3. 加樣
加不同濃度的標準品或處理後的待檢樣品和酶標抗體各50μL於上述已包被的反應孔中，置室溫孵育0.5小時。然後洗滌。
4. 加底物液顯色
於各反應孔中加入臨時配製的底物顯色溶液（TMB和H2O2）100μL，室溫10～30分鍾。
5. 終止反應
於各反應孔中加入2M硫酸50μL。
6. 結果判定
可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，說明待測物含量越低，陽性結果為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，於450nm處測各孔OD值，根據標準曲線計算各孔含量。
四、ELISA技術要求
在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，主要包括以下幾個方麵。
1. 固相載體的選擇
許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判斷其吸附性能是否良好。
2. 封閉劑的選擇
封閉是繼包被之後用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸附後固相載體表麵尚有未被占據的結合位點，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些位點，從而避免ELISA後續的步驟中抗原或抗體等的吸附。最常用的封閉劑是1%的牛血清白蛋白，也有用1%～5%的脫脂奶粉或1%的明膠作為封閉劑。
3. 包被抗體(或抗原)的選擇
將抗體(或抗原)吸附在固相載體表麵時，要求純度要好，吸附時一般pH在9.0～9.6之間。吸附溫度、時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用 4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行篩選，即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg\/mL等）進行包被後，在其他試驗條件相同時，測定結果OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg\/mL。
4. 酶標記抗體工作濃度的選擇
首先用直接ELISA法進行初步效價的篩選。然後再固定其他條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。
5. 酶的選擇
用於ELISA的酶要求純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩定，來源豐富，價格不貴，製備成酶結合物後仍繼續保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢樣本中不存在相同的酶。另外，它相應的底物也應易於製備和保存，價格低廉，有色產物易於測定。在ELISA中常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。
6. 酶的底物及供氫體的選擇
對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯的顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。TMB經HRP作用後共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，隻需與H2O2溶液混合後即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB無致癌性，在ELISA應用廣泛。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間以10～30分鍾為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用於H2O2，小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物，用蒸餾水溶解後，在底物緩衝液中密閉、低溫（2～8℃）可穩定1年。
第三節可視化微陣列芯片檢測技術
生物芯片技術是20世紀90年代初發展起來的一種高通量、大規模並行性分析檢測技術。它是利用分子間特異相互作用的原理，將多種技術如分子生物技術、免疫學、微加工技術、計算機等融為一體的一項分析檢測技術。與傳統分析檢測方法不同的是，它形成的微陣列使生化分析反應過程高度集成於某一載體之上，高通量地分析檢測成百上千種DNA、RNA、多肽、蛋白質等分子。目前常見的生物芯片有：基因芯片、蛋白芯片、糖芯片以及其他小分子生物芯片。
蛋白芯片技術是近年來蛋白質組學研究中興起的一種新方法，它是在基因芯片的基礎上發展起來的。蛋白芯片技術主要采用微陣列點樣等方法將大量生物大分子如抗原或抗體等樣品有序地固定在玻片、矽膠片、膜、多孔板等支持物的表麵，組成密集的二維分子陣列，然後與已標記的待測生物樣品中的靶分子實現特異性反應，反應結果用化學發光法、熒光法、酶催化底物顯色法、同位素法等方法顯示，最後通過特定的儀器對信號的強度進行快速、並行、高效地檢測分析，判斷樣品中靶分子的含量，從而達到分析檢測的目的。
一、生物芯片基底材料
生物芯片的製備質量與基底材料的選擇有著重要關係。載體材料須符合以下要求：（1） 表麵具有可與生物分子進行化學反應的活性基團；（2） 應具有足夠的穩定性和均一性；（3） 單位載體上生物分子有一定的固定量；（4） 具有良好的生物兼容性，不改變固定後生物分子的活性。
常用於製備生物芯片的基底材料有三類，分別是：（1） 二維支撐材料，如玻片、矽片和金膜；（2） 三維多孔材料，如多孔矽、聚丙烯酰胺、水凝膠、瓊脂糖凝膠等；（3） 高分子材料，如聚二甲矽氧烷（PDMS）。在以上基底材料中，玻片由於其具有的化學惰性、背景熒光低及表麵穩定而得到廣泛應用。近年來，高分子材料由於其具有材料組分豐富、易加工等優點，也越來越受到關注。
二、微陣列生物芯片的製備
微陣列生物芯片是在矽片、玻璃、凝膠或尼龍膜等基體上，通過芯片點樣儀自動點樣或采用光引導化學合成技術固定的生物分子微陣列。生物芯片根據分子間特異性相互作用的原理，將生命科學領域中許多個獨立平行的分析過程平行集成於芯片表麵，以實現對核酸、蛋白質等多靶標生物分子的準確、快速、高通量地平行化檢測。在基片上進行高密度地微陣列製備是微陣列芯片的關鍵技術，發展非常迅速，相繼出現了原位合成、預合成後點樣等兩類主要的製備技術。
1. 原位合成法
原位合成方法的原理是利用點樣係統將探針的合成部分逐步轉移到基體上，同時實現探針合成和轉移的目的。原位合成有光刻合成法和原位噴印合成法兩種方法。其合成探針的原理不同，前者是將探針的不同片段用化學合成的方式連接在一起，而後者用來合成探針的原料則是A、T、C、G四種堿基。該類方法主要用於製作寡核苷酸點陣芯片，采用了多項先進的技術和工藝，例如：利用組合化學的原理安排各寡核苷酸位點，使製成的芯片在反應後較容易地完成尋址。用表麵化學的方法處理其衍生化基質表麵，使核苷酸能固定在上麵，並耐受合成循環中某些試劑的侵蝕。用光導向平版印刷技術，使芯片表麵可用屏蔽物選擇性地讓不同位點受到光照的保護，從而可定點合成寡核苷酸中的各個堿基。
2. 點樣法
預合成後點樣是指製備微陣列芯片前，先將待固定的探針合成好，點樣係統需要做的就是把這些合成好的樣品塗印或噴塗在基片上。該類方法適合於多種生物樣品，如多肽、蛋白、寡核苷酸、基因組等，用配備有微量液體分配器工作頭的機器人係統，生物芯片點樣儀可完成微陣列的製備。根據點樣時點樣頭和芯片接觸與否可分為接觸式和非接觸式兩類。接觸式點樣頭有毛細管和鋼針兩種，鋼針是目前采用最多的一種點樣頭。接觸式點樣常用的基片是玻璃片。非接觸式點樣主要指預合成後微泵噴塗點樣。
（1） 生物芯片製備係統；（2） 多通道點樣針座；
（3） 接觸式點樣過程示意圖；（4） 點樣針實物圖
圖36點樣式生物芯片製備過程中的關鍵技術
以接觸式點樣為例，點樣方法的工作原理是基於毛細作用。鋼針和毛細管的工作頭尖部很小，直徑在100~200μm之間，往往在針尖開有寬度為 30~180μm的狹縫，儲樣量較大，一次吸樣可連續點滴幾百甚至幾千點。當工作頭伸入有探針樣品的孔板中時，因尖部結構微小尺寸產生的毛細作用會使得探針樣品被吸到針尖或狹縫內。在表麵張力的作用下，樣品會分布在針尖端麵、側麵和狹縫內。當攜帶有樣品的針尖與待點樣樣本接觸時，鋼針的縫隙一次可以吸取較多樣品，這樣就可以在一次吸樣後在同一塊載玻片和多塊載玻片上進行多次點樣。圖36是點樣式生物芯片製備過程中的主要過程的示意圖。
三、生物芯片圖像獲取及數據分析
生物芯片的圖像獲取及數據分析是指實現生物芯片上的大量點陣的信息閱讀，並轉化成可供計算機處理的數據。生物芯片點陣上的核酸或者蛋白質經過與目標DNA、目標抗原、抗體或者受體等目標靶分子結合後，產生信號。目前，生物芯片一般采用熒光物質進行標記。除此之外，也可以采用化學發光物質或者納米材料進行標記。常見的生物芯片掃描儀有激光共聚焦掃描儀和CCD掃描儀等。圖37為常見的生物芯片掃描儀及掃描圖像。
（1） 生物芯片熒光掃描儀；（2） 可視化生物芯片分析儀；
（3） 生物芯片熒光圖像；（4） 可視化生物芯片掃描圖像
圖37生物芯片掃描設備及掃描圖像
四、生物芯片檢測方法
生物芯片檢測技術可以分為兩類，即有標記檢測和無標記檢測。兩類檢測技術都包含了關鍵檢測參數，如檢測限（limit of detection， LOD）、靈敏度、動態範圍、多靶標容量、高通量和特異性等。
1. 有標記檢測
有標記檢測一般基於熒光探針、化學發光標記的探針或者納米材料標記探針進行檢測。將探針材料標記在DNA或者蛋白質分子上，通過芯片分析儀對生物芯片進行掃描成像、分析檢測。在掃描過程中，掃描儀檢測並記錄生物芯片上各陣列點的信號強度。
2. 無標記檢測
盡管有標記檢測方法具有其優點，但是仍存在成本高、時間長、通量低以及對生物分子有幹擾等缺點。無標記技術可利用生物分子自身的質量、介電性質和光學性質等特性進行檢測。表麵等離子共振(Surface plasmon resonance， SPR)是指當一束平麵單色偏振光以一定角度入射鍍在玻璃表麵的薄層金屬膜上發生全反射時，若入射光的波向量與金屬膜內表麵電子的振蕩頻率一致，光線即被耦合入金屬膜引發電子共振，即表麵等離子共振。由於共振的產生，會使反射光的強度在某一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱為共振角。共振角的大小隨金屬表麵折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表麵結合物的分子質量成正比。在該技術中，待測生物分子被固定在生物傳感芯片上，另一種被測分子的溶液流過表麵，若二者發生相互作用，會使芯片表麵的折射率發生變化，從而導致共振角的改變。
第四節微分電位溶出法快檢技術
利用微分電位溶出法的原理和絲網印刷電極技術可以研製重金屬快速檢測儀，采用嵌入式設計，易於儀器小型化，實現對食品中重金屬的現場快速檢測。
一、微分電位溶出法原理
電位溶出分析法（potentiometric stripping analysis, PSA)分為富集和溶出兩個階段，在溶出階段溶液中的氧化劑（如溶解氧或Hg2+等)的氧化作用，將工作電極表麵的汞齊化金屬氧化成離子進入溶液，工作電極上的電位隨時間的變化而變化，形成Et曲線。根據能斯特方程可以推導出：
E=E0+RTnFln2l(nD)12+RTnFlnt12τ－t（1）
其中，l為汞膜的厚度；D為金屬在汞膜的擴散係數；t為時間；τ為被測金屬離子溶出所經曆的時間。
微分電位溶出法是通過記錄(dt\/dE)E曲線進行定性定量分析：
dEdt=RTnF·τ+t2t(τ－t)=RT2nF·τ+tt(τ－t)（2）
取倒數：
dtdE=2nFRT·t(τ－t)τ+t（3）
當t≈τ\/2時，即在待測金屬的半波電位上，dtdE有極大值。
dtdEmax≈τ3·nFRT（4）
金屬離子濃度與τ的關係：
τ=CRSCOX·DRDOX23·td（5）
CRS=dtdEmax·3RTnF·COX·DRDOX－23·t－1d（6）
其他條件一致下，3RTnF·COX·DRDOX－23·t－1d是個常數，被測金屬濃度CRS與dtdEmax相關。
與常規電位溶出法相比，微分電位溶出法(dt\/dE)E曲線呈峰形，能有效增加信噪比，提高靈敏度。峰電位是定性分析的依據，峰高與待測物質濃度成正比，是定量分析依據。
二、絲網印刷電極技術
絲網印刷技術是一種曆史悠久的傳統實用技術，隨著微電子技術的發展，絲網印刷已成為電子產品應用領域中最常用的印刷方法。絲網印刷電極是將絲網印刷技術與電極相結合製成的一次性電極，它的厚度在幾微米至100微米之間，又被稱為厚膜電極。絲網印刷電極將原始工作電極、參比電極、輔助電極這三種電極整合在一起，具有製作成本低、響應速度快、重複性好、樣品用量少以及製作自動化等優點，因此已成功商業化。
絲網印刷的基本原理是：絲網印版的部分網孔能夠透過油墨，漏印至承印物上；而其餘部分的網孔堵死,不能透過油墨，在承印物上形成空白。現代一般用光化學製版法，該法是將絲網繃緊在網框上，然後在網上塗布感光膠，形成感光版膜，再將陽圖（菲林）底板密合在版膜上曬版，經曝光、顯影，印版上不需過墨的部分受光形成固化版膜，將網孔封住,印刷時不透墨；印版上需要過墨的部分的網孔不封閉，印刷時油墨透過，在承印物上形成墨跡。用絲網印刷技術製備一次性電極，主要優點包括：（1） 可以在物體表麵印刷各種圖案，設計十分靈活；（2） 印刷過程易實現自動化；（3） 重現性好；（4） 適用於各種材質；（5） 成本低廉。
圖38絲網印刷電極印製工藝流程
絲網印刷電極基質必須是電惰性的，並且符合價格低廉、容易加工的要求，常用的有高分子材料如聚氯乙烯(PVC)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)等軟性材質和陶瓷、玻璃等硬性材質。在早期，絲網印刷電極多采用硬性材質作為基底，但硬性材質與如今的電子設備兼容性不好，現在多采用軟性材質作為基底。
在基質板材表麵上所使用的印刷油墨主要由色料、連接料和油墨助劑組成。絲網印刷電極所用的色料有石墨粉、金粉、銀粉等，還包括電子媒介體以及導電材料等功能性色料。連接料主要起連接作用，主要有有機溶劑、樹脂、油和輔助材料等。助劑有稀釋劑、消泡劑、分散劑、減粘劑和防幹劑等。按照印刷油墨是否導電可分為導電油墨和絕緣油墨兩類。絕緣油墨是用於印製傳感器的絕緣層，而導電油墨則是用於印製傳感器的導電條和電極。目前用到的絲網印刷油墨有碳油墨、銀油墨、絕緣油墨等。
絲網印刷電極的集成工作電極和對電極為碳材料印製，參比電極為銀氯化銀材料印製；絲網印刷電極的基片為長條形白色不透明PET膜；電極之間的絕緣是通過壓製一層預製的PET膜或印製絕緣油墨形成絕緣層。絕緣層留出電極部分形成微型電解池，用於滴加試樣到電極上。
如圖39所示，絲網印刷電極基片301選用白色PET膜，為長條形，厚度大於0.15mm，電極接頭302是插進插槽105（圖310）連接恒電位模塊203（圖311）。工作電極303和對電極304用導電碳油墨印製；參比電極305為銀氯化銀導電油墨印製。藍（綠）色PET膜306一麵塗有膠預先經衝裁出異型孔307，在電極上壓製PET膜306形成絕緣層，對應異型孔307則是三電極303、304和305形成電解池腔，檢測試樣時就是將試樣滴加至電解池腔。工作電極303所用的碳材料不同，會導致其化學性能的不同，對於不同重金屬檢測，需要對應不同碳材料印製的工作電極。
圖39絲網印刷電極結構圖
三、便攜式重金屬快速檢測儀結構和使用
如圖310所示，便攜式重金屬快速檢測儀包括殼體101，殼體101正麵上部有液晶屏102，下部為按鍵103，殼體101背麵下部電池盒104，內置充電電池，殼體101側麵上端有絲網印刷電極的插槽105，殼體101側麵下端分別設有電源插口106和通訊口107，殼體101內置工作主板108。通過模塊化設計的檢測儀，其工作過程主要分為數據采集、數據分析處理和結果輸出等部分，其中數據采集通過讀取絲網印刷電極上的電位信號來解決，數據的分析處理主要通過工作主板實現，處理結果的輸出則通過顯示屏完成。將檢測不同重金屬對應的絲網印刷電極，插入檢測儀殼體的插槽，完成鉛、鎘、銅等多種重金屬的痕量檢測，作為一種重金屬的獨立的檢測係統，實現數據的分析、輸出和存儲，也可以通過通訊口將數據傳輸到計算機等供存儲和分析。
圖310重金屬快速檢測儀的實物結構圖
圖311重金屬檢測儀的模塊框架圖
模塊化設計主要體現在核心部件工作主板上，包括控製單元、D\/A和 A\/D 模塊、恒電位模塊、按鍵區及電源模塊等。采集數據完成後會自動生成 dt\/dE 的微分數據，這樣在采集過程中完成數據的微分化處理，節省采集後數據計算分析的工作量，如圖311。
微分電位溶出法同陽極溶出法相比，由於在溶出階段是化學氧化過程—形成電位溶出信號，而非陽極溶出法的電化學氧化過程—形成電流溶出信號，對於數據采集電路，相比電流信號，電位溶出信號抗幹擾能力更強，因而結構簡單，耗電更少，體積更小，便於攜帶，更適合現場檢測。
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第二篇
食品安全分析綜合實訓
第四章現場快速分析檢測實驗
第四章現場快速分析檢測實驗
實驗一可視化微陣列芯片試劑盒檢測豬肉中的瘦肉精
一、目的和要求
1. 了解可視化微陣列芯片試劑盒檢測豬肉瘦肉精的方法和原理。
2. 掌握豬肉樣本中瘦肉精同時檢測的前處理方法。
3. 掌握芯片試劑盒的檢測方法。
4. 通過對豬肉樣本中瘦肉精檢測結果的分析，了解影響測定準確性的因素。
二、實驗原理
可視化微陣列芯片用於豬肉中瘦肉精殘留檢測是基於間接競爭免疫分析原理。可視化微陣列芯片微孔中包含有克倫特羅和萊克多巴胺的人工抗原點，當在微孔反應區內加入待測樣品與相應抗體後，遊離的待檢物和芯片上固定的人工抗原點競爭結合相應的抗體。因此遊離的待檢物越多，抗體與固定在芯片上的相關抗原點的結合量就越少。待反應完畢洗滌後，加入納米催化顯色試劑，納米顆粒經催化反應直徑顯著增加，在芯片表麵形成肉眼可見的黑色斑點。各黑色斑點通過芯片分析儀自動掃描檢測後可獲得各斑點的相關灰度值。由於樣品中殘留的克倫特羅和萊克多巴胺含量與樣品的灰度值呈負相關，經芯片分析軟件與標準曲線自動比較計算後，即可得出各相關瘦肉精含量，最終可實現多個瘦肉精樣品的同時定量檢測。
三、儀器與試劑
1. 儀器
芯片分析儀（QArray 2000,祥中科技）；均質器；振蕩器；離心機；恒溫振蕩儀；天平(感量0.01g)；容量瓶(100mL)；聚苯乙烯離心管（2mL，15mL）；微量移液器(單道20μL~200μL，100μL~1000μL)。