為了獲得更多的有用次級代謝產物,需盡可能地提高培養密度。然而,高密度細胞培養涉及許多技術問題(TANAKA,1981)。這是因為植物細胞具有較硬質的細胞壁,比微生物細胞大10~100倍,因此它們對流變壓力有更高的敏感性。植物細胞還有相互聚集,形成聚集體的趨勢。一方麵在高供氧和強攪拌下,過分攪動會使細胞聚集體破裂死亡;另一方麵高密度培養下培養液黏度增大,引起氧和營養物質的傳輸受限,細胞會因缺乏養料褐化衰竭。我們對不同接種量的研究發現,細胞接種量在3.5gdw/L—5gdw/L的範圍內,細胞生長良好,可以達到較大的產量。同時,我們采用了大直徑攪拌槳和低攪拌速度,提高了反應器的傳輸性能。
初始接種量4.5gdw/L,在反應十二天結束後,得到高達19.52gdw/L的細胞生長量。水母雪蓮高產黃酮細胞係遺傳性能穩定:利用固體和懸浮培養,經過20多次的繼代調查,實驗結果表明水母雪蓮高產黃酮細胞係細胞生長及有效次生代謝產物含量穩定。細胞係遺傳性能穩定是實現產業化的關鍵之一。水母雪蓮適合細胞發酵培養:植物細胞培養工業化生產有效次生代謝產物的關鍵問題是植物細胞能否生長在大型生物反應器內。我們開展了2L和5L的通氣攪拌式發酵培養的研究。
實驗結果表明雪蓮細胞培養物總黃酮生產量為0.8~0.9g/L。此項研究為生物反應器放大培養提供了理論依據。
3.雪蓮細胞培養物中黃酮類有效成分的研究
已經建立培養物中有效成份高車前素(hispidulin)和金合歡素(jaceosidin)的分離、提取工藝及鑒定方法。利用HPLC、MS、IR、UV等光譜分析對以上二種活性成分作了結構分析。
4.雪蓮培養物有效成分的初步藥理和急毒性實驗
野生水母雪蓮和水母雪蓮細胞培養物以相同提取方法得到雪蓮黃酮粗提物,並以相同方法測定總黃酮含量。利用野生雪蓮作對照,觀察雪蓮培養物中總黃酮提取物對小鼠的抗炎、鎮痛和急毒性作用。結果顯示細胞培養物有明顯的抗炎鎮痛作用,作用強度與野生雪蓮大致相同。雪蓮培養物總黃酮提取物LD50為1262.51mg/kg,野生的LD50為1250.56mg/kg,兩者基本相同。初步藥理實驗結果表明,用植物細胞培養物產生的有效次生代謝產物完全可以代替野生植物資源。
5.雪蓮細胞培養物經濟效益分析
從研究結果可以看出,雪蓮高產黃酮細胞係遺傳性能穩定,培養物有效成分含量高,發酵周期短。用現代化學分析手段和初步藥理及急毒實驗證明雪蓮細胞培養物能夠產生野生植物的有效次生產物,以及未發現有毒物質的產生,此項研究為雪蓮細胞大規模的培養,以工業化生產有效次生產物奠定了基礎。用野生雪蓮研製的雪蓮注射液和雪蓮風濕膠囊對治療風濕症、偏癱等具有良好的作用,目前暢銷香港、東南亞等地區和國家。高山雪蓮生長環境特殊,人工栽培困難,生長緩慢,成熟期需要3~4年,價格昂貴。由於過量采挖雪蓮麵臨滅絕的危險。雪蓮有效成份化學結構複雜,難以化學合成。通過植物細胞大量培養生產植物藥可不受自然條件的限製,對藥物質量容易控製。不占用耕地麵積。植物細胞大量培養是利用植物細胞體係,通過現代生物工程手段,進行工業化規模生產,以獲得各種產品,是一門新興的跨學科技術。利用細胞培養生產的雪蓮總黃酮原材料價格上比野生的大大降低了成本,同時對保護野生資源維護生態平衡具有重要意義。
6.雪蓮的推廣應用
建議雪蓮是一種名貴植物藥材,具有散寒除濕、壯陽補血、抗炎鎮痛、延緩衰老等作用。民間用於治療風濕性關節炎、婦女月經不調、高山不適應症等。雪蓮在計劃生育,化妝品等方麵開發潛力也很大。據《江蘇中醫》報道(1996),雪蓮通脈丸治療偏癱82例證明具有良好的效果。雪蓮花的化妝品係列:雪蓮揮發油研製的雪蓮係列化妝品(護膚霜,防曬霜,兒童霜)含多種營養和活性成分,滲透性好,易吸水,效果長,有明顯延緩皮膚衰老,營養皮膚細胞,增加皮膚彈性等功能。此產品是我國首家獲得巴黎國際發明博覽會發明獎的化妝品。並獲得首屆全國輕工業產品博覽會銀質獎等6種獎(中國科學報1994,10,21)。新疆中藥總廠生產的雪蓮注射液和雪蓮風濕膠囊對治療風濕症具有良好的作用。雪蓮有多種藥用功能,利用有效成分的不同極性可考慮雪蓮培養物的綜合利用。如多糖有終止妊娠以及抗疲勞、抗缺氧等作用,可用於計劃生育和保健品(多糖是一類水溶性化合物,可用水作提取溶劑);黃酮、生物堿有抗炎、鎮痛、強心、平息、降壓等作用(中等極性)。雪蓮不但是名貴中藥材,而且還可用雪蓮揮發油研製雪蓮係列化妝品(揮發油為強親脂性中藥成分,極性小,可選用石油醚作提取溶劑)。
7.查新及專利申請
雪蓮細胞培養生產有效成分的研究,通過中科院文獻情報中心查新,未發現有類似的研究成果。對雪蓮細胞高產黃酮細胞係申請了國家專利,專利申請號(No.00123740.3和 _disibledevent=0.9865。說明棉酚的含量主要是受遺傳因素的影響。此實驗為研究道地藥材的成因提供了一種可行的思路,即在基因表達水平上確定有效成分含量與基因的關係,進而確定形成道地性的主導因素,指導道地藥材的發展。