4.3藥用植物道地性研究上的應用
道地藥材具有強烈的地域性,表現在它們往往分布在某些狹小的區域,或雖分布較廣但隻有某些狹小生境區的質量最好、療效最佳、產量最大。道地性藥材的質量、療效、產量等受到所在地的限製原因是植物的遺傳物質DNA及初生的和次生代謝過程中的酶係統發生了道地性的變化。因道地性藥材與非道地性藥材是同種,二者在形態和生藥性狀等特征上差別不明顯,給鑒別帶來困難,采用DNA分子遺傳技術並輔以等位酶技術,可以從分子水平區分道地性藥材。陳林姣等(1998)采用RAPD技術對中藥溪黃草類 4種原植物進行了鑒定研究,對藥材的“道地性”研究有重要意義。
4.4在藥用植物親緣關係鑒定上的應用
目前藥用植物親緣學所采用的往往是藥用植物的小分子成分,即植物的次生代謝產物,而忽視了大分子成分如DNA,但它們從本質上反映了藥用植物的親緣關係,而且決定著藥用植物藥效成分形成過程中的關鍵酶的合成等。所以,現在很多學者建議應把小分子化合物和DNA結合起來考慮,才能更有效地研究藥用植物的親緣關係。日本學者神田博史研究發現竹節參Panax japonicus的主要皂苷在狹葉假人參P.japonicus var.angustifolius中有相當高的含量但RAPD和RFLP分析表明這兩種植物有明顯區別。可見,植物大分子成分與小分子成分之間的關係尚待深入研究。在國內對這方麵的研究已有諸多報道。汪小全等用 5個引物對升麻屬的5個種和類葉升麻及烏頭屬的一種進行了RAPD分析,結合分析的結果,認為類葉升麻屬與升麻屬有較近的親緣關係,而烏頭屬則與該屬較遠,這與經典分類學的研究結果相吻合。陳毓亨等對溫鬱金和川鬱金進行了RAPD研究,結果表明2種親緣關係很近,聚類結果表明難以從DNA水平上把二者劃分為2個種,結合化學和形態資料,認為2種應予以合並學名。此外,還證明溫鬱金與毛鬱金有較為密切的親緣關係。
4.5在生藥鑒定上的應用
傳統上生藥鑒定,主要依靠藥的顏色、形狀、氣味、味道、質地等感性認識,這種方法鑒定不準確,有很大人為因素,即使引入組織學和化學法來鑒定生藥,也仍然存在很大的局限性。利用分子遺傳標記技術可以直接從DNA進行分析,可最本質地鑒定藥用植物,因而是一種便捷、準確的生藥鑒定方法。香港邵鵬柱實驗室率先將DNA分子標記技術用於中藥材的鑒定研究。1994年,他們首次報告利用 Ap-PCR技術對人參及西洋參進行了鑒定研究以及利用 RAPD技術對真假人參進行分析鑒定。張榮等用RAPD分析法對木藍屬8種生藥及鐵線蓮屬7種中藥進行鑒定研究。Fushimi等采用18s-rRNA基因片段進行測序分析,能鑒別開中國川芎和日本川芎。Nakai等用RAPD和PCR-RFLP方法對淫羊藿屬8種植物進行了DNA分析,結果發現RAPD指紋較易區別中國特有種箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum(S.et.Z)Maxim.和日本其它7種淫羊藿,同時采用葉綠體基因組rbc L(引物間距約1.4kb)片段擴增後,用Scr F1酶解進行了RFLP分析,表明日本7種淫羊藿屬內變異較大,與形態學結果不符。
雪蓮細胞大規模培養產業化生產藥用有效成分
趙德修金治平瞿文全陳亞瓊付春祥。(中國科學院植物研究所,北京,100093)
水母雪蓮係菊科鳳毛菊屬植物,產於我國甘肅、青海、西藏等地的高山礫石間,海拔4000m~5100m處。民間用於治療風濕性關節炎、陽痿、婦女月經不調、胎衣不下、高山不適應症等。最近臨床及藥理研究證明,雪蓮可延緩衰老及治療腦動脈硬化等症。雪蓮提取物中高車前素和金合歡素對治療癌症、抗多種炎症等具有良好的作用。用雪蓮研製的雪蓮注射液和雪蓮風濕膠囊,目前暢銷東南亞、香港等地區和國家。但雪蓮人工栽培未能成功,由於掠奪性的采挖,雪蓮資源已經嚴重匱乏。
為保護國家珍稀植物,滿足臨床上的需要,我們開展了雪蓮植物細胞大量培養生產有效成分的研究。該研究工作綜述如下:
1.雪蓮細胞培養工藝學的研究
1.1雪蓮細胞固體培養利用
目視法篩選得到的高產黃酮細胞係在固體培養條件下細胞生長率為幹細胞20±2g/L,總黃酮含量為4%~5%。培養周期為15~16d。
1.2雪蓮細胞的懸浮培養利用
本實驗室篩選得到的高產黃酮細胞係,在搖床上進行懸浮培養,細胞生長量為DW19±1g/L,細胞總黃酮生產量為0.7~1.0g/L。培養周期為12d。
1.3雪蓮細胞的生物反應器發酵培養
雪蓮細胞在2L機械及5L磁力攪拌生物反應器培養條件下細胞生長量為DW14~16g/L培養物總黃酮生產量為0.5~0.8g/L,培養周期為12 d.研究結果表明水母雪蓮細胞培養物黃酮含量高。1996年徐國鈞報道(見中國藥材學),目前由培養物產生的代謝產物有200種以上,約有30種植物培養物產生的化合物含量接近或超過原植物。文獻中列舉了17種培養物產生的化合物超過原植物,但僅有5種化合物超過原植物5倍以上。而雪蓮培養物產生的黃酮次生產物超過原植物6~7倍。從研究結果還可以看到,水母雪蓮細胞懸浮培養周期短。水母雪蓮細胞懸浮培養周期12d,文獻報道三尖杉懸浮培養需要30d,固體培養60d;人參懸浮培養30 d,固體培養60d;紫草懸浮培養25~30d。
2.雪蓮細胞生長及其有效次生產物生物合成的調控不同理化因子對雪蓮細胞生長及黃酮形成的影響對八種基本培養基進行篩選,對篩選得到的MS基本培養基又作了培養基成分的調查,如碳、氮源、溫度、pH值、光照等對雪蓮細胞生長和次生產物的提高均有明顯的影響。通過以上培養條件的選擇使黃酮產量比原愈傷組織提高2~3倍。植物激素及前體和添加物對雪蓮細胞生長和次生產物的產量均有一定的影響。在細胞懸浮培養過程中發現植物細胞較微生物生長緩慢(<0.1g/L/d),低產率(0.02g/L/d 或更少)。