3.細胞水平的研究
Volk從細胞學角度揭示了羊肚菌的生活史:子實體的發育、子囊孢子的發育、營養菌絲的形成、異核體的形成、菌核的形成、菌核的萌發和原基的發育。他特別指出羊肚菌營養菌絲的每個細胞分區中,平均有10~15個細胞核,且常發生菌絲融合,作為靜止結構的菌核,實際上是由初生菌絲或次生菌絲的重複分枝及菌絲末端的膨脹構成的假菌核。子囊的發育是通過自核交配而不是通過子實體子實層基內的菌絲融合而重新形成異核體。陳易飛、林彬分別對羊肚菌、粗腿羊肚菌的子實體進行顯微觀察;李綺等應用電子顯微鏡對羊肚菌子實體的亞顯微結構—膜邊體、高爾基體、線粒體、隔膜與伏魯寧體進行了觀測研究。張鑒銘等從培養在培養基中的尖頂羊肚菌菌絲體分離出原生質體,用纖維素酶2%+崩潰酶1%+半纖維素酶0.5%+蝸牛酶0.5%的酶液,發現在30℃下經4.5小時處理的產量最高,為6.2×10-6個原生質體/100mg/ml。由此分離的原生質體再生能力很強,液體培養18小時即可再生成菌絲。劉士旺等的研究結果表明多種酶的混合使用較單一酶效果好,選用蝸牛酶4mg/ml+溶壁酶5mg/ml+纖維素酶4mg/ml作為酶解液原生質體產量最高,原生質體再生率較以前提高5.5倍;通過誘變羊肚菌原生質體,獲得原生質體誘變再生株尖頂羊肚菌(M.conica)CGAC—950637,其生物量和總氨基酸比出發菌株都有所提高。影響原生質體形成的因素有機械作用、菌絲培養方式、菌齡、酶解時間、溫度、不同穩定劑及緩衝液,打散菌絲體的方法無法產生原生質體。
4.生化與分子生物學的研究
Moriguchi M等從羊肚菌菌絲中分離純化到3個γ—穀氨酰轉肽酶,分子量分別為155,000 Da;219,000 Da;102,000 Da。這三種酶催化不同γ—穀氨酰複合物的水解和轉肽反應,水解Km在10-5~10-4數量級之間;轉肽Km為10-4~10-2數量級之間。該酶活性被L—絲氨酸和硼酸鹽抑製。龍正海等發現不同生長時期菌絲體的氨基酸含量變化較大,與此同時酯酶同功酶活性也呈現相應的變化規律,表明羊肚菌菌絲體生長過程中酯酶同功酶活性跟氨基酸代謝之間存在一定相關性。同功酶分析還發現不同子實體菌株及同一子實體不同單孢菌株間的酯酶同功酶譜基本相同,子實體與菌絲體均具有穩定的9條酶帶。王新宇等發現黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌和羊肚菌在相同培養液及培養條件下,菌絲體產量、總蛋白及可溶性蛋白質的含量無顯著差異;同一個種在含不同濃度麥芽糖、蛋白腖和維生素B1培養基上生長時,總蛋白和可溶性蛋白質的含量無顯著的差異,但菌絲體產量差異較大,酯酶同功酶的組成也有一定的差異。
Bisakowski B等將羊肚菌的粗提取物用硫酸銨沉降得到脂氧合酶,研究發現部分純化的脂氧合酶提取物在pH3.0顯示最大活性,在pH4.0~6.0顯示62.5%的活性,在pH7.0~10.0時則小於12.5%;動力學研究結果為酶的最大反應速度Vmax=0.314摩爾/毫克分和Km=1.59×10-4M;酶在亞油酸為底物時顯示強的活性,而使用亞麻酸時隻有29%的活性,單、雙、三亞油酸時大約隻有11%的活性;脂氧合酶對花生四烯酸顯示了相對較強的親和力(83%)。脂氧合酶在pH6.0的條件下催化亞油酸轉化為9、10、12、13-氫過氧化物的速率比36∶24∶14∶26。在羊肚菌多酚氧化酶催化下,多酚複合物通過結合甲基硫醇形成氧~醌。羊肚菌在pH為7時,有較高的結合硫醇的性質,而其羥基苯的衍生物含量低,可見其它化合物也參與了反應,羊肚菌多酚氧化酶底物專一性相對於水果、蔬菜或含有單酚和雙酚氧化酶的蘑菇而言是低的。此項研究表明羊肚菌在除臭(包括口臭)方麵有廣闊的應用前景。
Yu S等從尖頂羊肚菌、粗羊肚菌中純化到α—1,4—葡聚糖裂合酶,該酶能催化具有α—1,4—葡糖苷鍵的葡萄糖寡聚物和多聚物(如麥芽糖),產生1,5—脫水—D—果糖。酶的分子量約為121000Da,pH各為4.5和4.4,最適pH範圍在5.5~7.5之間,pH6.5時表現最大酶活力,酶反應適溫在37~48℃之間(具體要視基質而定)。酶的抑製劑有PCMB、葡萄糖、麥芽糖等及類似物;測定酶的約35%的氨基酸序列後發現所測序列中兩個酶有91%是相同的;兩個酶顯示免疫交叉反應。Bojsen K和Yu S等進一步研究了上述兩種羊肚菌α—1,4—葡聚糖裂合酶的基因,發現各有3201bp和3213bp的編碼區,在兩個基因的同一位置發現了13個小的內含子;兩個酶在氨基酸水平有86%的相同,它們各自編碼1066和1070個氨基酸;酶基因啟動子的分析揭示了一些假定的DNA調節元件,如Area和Crea位點,它們分別與氮和碳代謝相關。還有CCAAT/CAAT盒,則與基因表達有關。對從真菌Peziza中分離的裂合酶基因557個bp進行測序,由所測核酸片段推出的氨基酸序列與粗羊肚菌裂合酶有76%的相同。他們還將粗羊肚菌裂合酶基因轉入畢赤酵母和曲黴屬細胞內並得到了表達。Rohe M對位於尖頂羊肚菌的線粒體內的兩個線性質粒之一pMC3~2 進行了測序,大小為1044bp,有末端倒轉重複序列分別長713bp 和710bp,兩個開放閱讀框,跨度分別為2706bp和918bp。ORF1可能編碼一個病毒的B型DNA聚合酶;而ORF2,則尚未見有已發表的蛋白質或DNA序列同源。質粒pMC3~2結構和其他絲狀真菌中分離到的線性質粒一樣,與腺病毒的遺傳元件有較近的關係。
將分離到帶有線性質粒pMC3~2的線粒體RNA,凝膠電泳,然後用線性質粒pMC3~2作為探針進行Northern雜交。得到的雜交片段隻是pMC3~2的中心部分和特有的(線粒體 RNA)mtRNA的片段。雜交片段(2.8kb和1.0kb)的大小與從核苷酸序列推斷出的pMC3~2的兩個ORF的長度一致。因此,編碼DNA聚合酶和一個未知蛋白的兩個ORF是在帶有質粒的羊肚菌線粒體中轉錄的。核糖體核糖核酸(rRNA)是存在於生物細胞內的“活化石”,其基因rDNA分子進化信息量大,趨同性小,可比性強,已被廣泛選作生物發育係統學的分子指標,也是係統發育物種概念界定物種的依據之一。為了從分子水平研究羊肚菌屬真菌的分類和係統發育地位,羊肚菌的5.8S、17S、18S、25 S、28S rRNA基因序列;尖頂羊肚菌5.8S、17S、25S rRNA的基因序列已陸續被測定。用基因步行法對羊肚菌和尖頂羊肚菌編碼rRNA基因的內部轉錄空間ITS從兩個方向進行測序後表明,兩個種的ITS有差異,羊肚菌為750bp,尖頂羊肚菌1150bp。對羊肚菌屬、鍾菌屬、盤菌屬和跟它們親緣關係很近的鹿花菌屬的28S rDNA通過PCR擴增,發現存在著限製性片段長度多性RFLP,可由此推斷出它們的種係發生的關係。28SrRNA基因的5‘端的多態性比3’端的多。根據RFLP,分離的三個尖頂羊肚菌與本研究中 的其它羊肚菌的差異分別為0.5%、1.0%和1.5%。而鹿花菌gigas與羊肚菌的差異約為6.2%。在某些情況下,種內比不同種間有更多的遺傳多樣性。結果支持了羊肚菌屬隻有幾個(可能三個)多態種的假說。