pET 係列載體是利用大腸杆菌T7噬菌體轉錄係統進行表達的載體。pET 係列載體的構建的原理如下：T7噬菌體基因編碼的T7RNA聚合酶選擇性地激活T7噬菌體啟動子的轉錄，並對大腸杆菌任何基因的啟動子沒有激活作用。它是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大腸杆菌RNA聚合酶快5倍左右，可以轉錄某些不能被大腸杆菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。在細胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的情形下，大腸杆菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉錄體係，最終受T7噬菌體啟動子控製的基因的轉錄能達到很高的水平，在適宜的條件下，T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子表達係統表達的基因產物可占細胞總蛋白的25%以上。另外，T7噬菌體RNA聚合酶對大腸杆菌RNA聚合酶的抗生素（如利福平）有抗性，可用以某些不能被大腸杆菌RNA聚合酶有效轉錄的序列，高水平地表達在其他表達係統中不能有效表達的基因。因此，對於T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子表達載體係統中除了有T7噬菌體啟動子還需有合成T7RNA聚合酶的基因，並處於可控製狀態。
大腸杆菌BL21（DE3）是常用的pET 表達載體的宿主菌，該菌對T7噬菌體RNA聚合酶和目的基因的轉錄實行多層次的調控。
在該菌株BL21區整合有一個λ噬菌體的DNA，在λ噬菌體的DE3區有一個T7RNA聚合酶的基因（T7基因1），該基因受lacUV5啟動子控製。當pET載體進入BL21（DE3）細胞後，由於宿主細胞的lacI基因表達產物的抑製，lacUV5啟動子不能開始轉錄，便不能產生T7RNA聚合酶，載體上的目的基因由於缺乏T7RNA聚合酶的識別啟動而無法轉錄。當存在IPTG誘導物後，lacUV5啟動子被抑製作用解除，T7RNA聚合酶基因表達產生T7RNA聚合酶，從而啟動T7啟動子控製的外源基因的表達。
表達載體pET 5α是典型的T7噬菌體啟動子表達載體，其組成是在載體的基本結構的基礎上加入了T7噬菌體啟動子序列及其下遊的幾個酶切位點。當外源基因插入到這些酶切位點後，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。
8.3外源蛋白質表達部位
大腸杆菌細胞被內膜（又稱質膜）和外膜分隔成胞內、周質和胞外三個腔室，相應地在E.coli中表達的異源重組蛋白可定位於胞內、周質空間或胞外培養基中。外源目的基因在原核細胞中的表達形式包括包涵體、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白等5種，有些在細胞質中表達，有些在細胞周質中表達，還有的則分泌到細胞外，然而表達部位不同，對製備克隆基因的表達產物有很大的影響，各種表達形式各有利弊，目前關於如何獲得有生物活性的蛋白是科研工作者研究的重點。
8.3.1細胞質表達
1.包涵體概念及性質
細胞質中表達的外源蛋白多以包涵體的形式存在。所謂包涵體（inclusion bodies，IB），是指存在於細胞質中的一種不可溶性的蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物，除了主要含有重組蛋白外，還有RNA聚合酶、核糖核蛋白體和外膜蛋白、DNA、質粒DNA、RNA、脂多糖等，具有很高的密度。包涵體具有正確的氨基酸序列，但空間構象往往是錯誤的，因而沒有生物活性。包涵體具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，隻溶於變性劑（如尿素、鹽酸胍等）。包涵體在相差顯微鏡下觀察為黑色的斑點，也稱為折射體（refractile body）或光遮射體。
以包涵體形式表達的外源蛋白有其優缺點，其優點表現在：①簡化了外源基因表達產物在大腸杆菌細胞內的分離純化程序，因為包涵體的水難溶性及其密度遠大於其他細胞碎片結合蛋白，通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來；②以包涵體形式存在於細胞中，外源蛋白在宿主細胞中往往麵臨著被宿主細胞的蛋白酶降解的威脅，形成包涵體速度較快時，就可以避免降解；③蛋白質的產量高，二硫鍵的斷裂以及轉譯修飾作用的喪失，會導致外源片斷編碼的蛋白質在大腸杆菌中超量表達；④蛋白質沒有活性，因此不會使宿主細胞受傷害。