③SD序列與起始密碼子之間的距離以9±3個核苷酸為適宜。也有報道，如果SD序列同16S rRNA3′端的互補堿基大於8，那麼上述兩者之間的距離不重要。④除SD序列外，處於起始密碼子前的兩個核苷酸應該是A 和U（在－3位應為A），即AUA 序列。⑤如果在起始密碼子AUG 後的序列是GCAU 或AAAA，能使翻譯效率提高。⑥在翻譯起始區周圍的序列應不形成明顯的二級結構。實驗表明，通過突變mRNA5′末端翻譯區減少或除去某些莖環結構可以提高翻譯的起始效率。
對於真核細胞基因，在mRNA的5′末端翻譯區不存在SD序列，但對絕大多數有效的mRNA翻譯起始而言，一個共有序列5′CCA（G）CCATGG 3′是必需的，而其中最重要的是在－3位應是嘌呤堿基，而在＋4位應是G。通過突變改變起始密碼子附近的這一共有序列，可使翻譯起始頻率下降90%。如果在起始密碼子的上遊區存在另外一個起始密碼子，而特別是又不被一個符合讀碼框的終止密碼子所隔斷，那麼這個上遊起始密碼子會降低正常翻譯的起始。在表達載體構建中應注意這些問題。
8.4.4終止密碼子選擇與外源基因高效表達
在原核生物中，翻譯的終止由兩個釋放因子所調控，RF1識別UAA 和UAG，而RF2識別UAA 和UGA。三個終止密碼子的翻譯終止效率是不同的，其中UAA 在基因高水平表達中終止效率最高。特別是在原核細胞中，由於UAA 為兩個釋放因子所識別，因此在基因工程中。一般采用UAA 作為終止密碼子。在實際操作中，為了保證翻譯有效終止，萬全之策是用一連串的終止密碼子，而不隻是一個終止密碼子。
8.4.5外源蛋白的穩定性與外源基因高效表達
外源蛋白質表達後是否能在宿主細胞中穩定積累，不被內源蛋白水解酶所降解，這是基因能否高效表達的一個重要因素。蛋白質水解是一個非常有選擇性的、嚴格控製的過程，它影響到蛋白質在細胞中的積累。很多克隆的蛋白質被宿主細胞中的蛋白水解體係視為“非正常”蛋白而加以水解。這種選擇性降解意味著，受體細胞中的自身蛋白所具有的確定的構象特性，使其不受蛋白水解酶的降解。如果外源蛋白的構象與天然產物相似，遭到降解的可能性就低。
可采取以下措施避免表達的蛋白被選擇性降解：
（1）構建融合基因，產生融合蛋白 融合蛋白的載體部分通過構象改變，使外源蛋白不被選擇性降解。這對編碼相對分子質量較小的多肽或蛋白的外源基因尤為合適。
（2）構建成可分泌的蛋白 通過基因操作將外源蛋白的N 端帶上信號肽，使外源基因表達產物可以分泌到E.coli 細胞的周質或直接分泌到培養基中。應該指出，並不是所有的外源蛋白都可以通過基因操作成為可分泌蛋白。
（3）使外源蛋白在宿主細胞中以包涵體的形式表達 這種不溶性的沉澱複合物可以抵抗宿主細胞中蛋白水解酶的降解，也便於純化。然而，包涵體的形成給如何獲得具有天然構象和活性的蛋白質提出挑戰。經過包涵體純化的重組蛋白必須經過變性複性的處理，此過程到目前也沒有統一的工藝過程。盡管目前還利用包涵體來高效表達外源基因，但人們正在努力尋求出一種穩定、可溶（或分泌）的高效表達技術。總之，構建表達載體應根據表達體係的特性，選擇性地應用上述原則，刪除降低外源基因表達的一些元件，插入提高外源基因表達的一些必需元件。
（4）提高外源蛋白的穩定性 大腸杆菌中含有多種蛋白水解酶，某些外源基因的表達產物會被宿主細胞的蛋白水解酶識別而降解。因此，須采取多種措施提高外源蛋白在大腸杆菌細胞內的穩定性。常用的方法包括：①采用分泌型表達載體係統，使外源基因表達的蛋白質分泌到細胞周質腔或直接分泌到培養基中，避免細胞內的水解酶對表達蛋白的降解。②使目的基因表達為融合蛋白的一部分。融合蛋白形成的雜合構象，能在較大程度上封閉外源蛋白分子上的水解酶位點，從而增加其穩定性。③構建包涵體表達係統，外源基因的表達產物以包涵體的形式存在於受體細胞中，這種難溶性沉澱複合物不易被宿主細胞蛋白水解酶所降解。
④選用某些蛋白水解酶缺陷型菌株作為受體菌，這種細胞中具有較低水平的水解酶活性或完全喪失某種水解酶活性，可保證基因表達產物在受體細胞內的相對穩定。⑤對外源蛋白水解酶敏感的序列進行修飾或改造。
（5）減輕宿主細胞的代謝負擔。外源基因在細菌中高效表達，合理地調節好宿主細胞的代謝負荷與外源基因高效表達的關係，是提高外源基因表達水平不可缺少的環節。
8.5表達產物的檢測
8.5.1含有報告基因的融合蛋白表達的檢測
報告基因編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其他目的基因相融合，在調控序列控製下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體，鑒定基因表達狀況，因而作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方麵必須具有以下幾個條件：①已被克隆和全序列已被測定；②表達產物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉染的細胞中無相似的內源性表達產物；③其表達產物能進行定量測定。常使用的報告基因如熒光素酶基因（luciferase gene），該酶在有ATP、Mg2＋、O2和熒光素存在下發出熒光，這樣就可將表達載體用X 光片或專門儀器進行檢測。綠色熒光蛋白（gfp）基因編碼綠色熒光蛋白，該蛋白來源於海洋生物水母，其肽鏈內部第65～67位絲氨酸脫氫酪氨酸甘氨酸通過自身環化和氧化形成一個發色基因，在長紫外波長或藍光照射下發出綠色熒光。新黴素磷酸轉移酶基因（npt Ⅱ）、氯黴素乙酰轉移酶基因（cat）及慶大黴素轉移酶基因均為抗生素篩選基因，相關的酶可以對底物進行修飾（磷酸化、乙酰化等），從而使這些抗生素失去對宿主的抑製作用，使得含有這些抗性基因的轉化體能在含這些抗生素的篩選培養基上正常生長。選用何種報告基因可根據其特性進行篩選。