酵母菌(Yeast)是一類以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細胞真核微生物,並非係統分類單元,分屬於子囊菌綱(子囊菌酵母)、擔子菌綱(擔子菌酵母)和半知菌類(半知菌酵母)。目前已知有1000多種酵母菌。根據酵母菌產生孢子(子囊孢子和擔孢子)的能力,可將酵母菌分成3類:形成孢子的株係屬於子囊菌和擔子菌;不形成孢子但主要通過芽殖來繁殖的稱為不完全真菌,或者叫“假酵母”。如果說大腸杆菌是外源基因表達最成熟的原核生物係統,那麼酵母菌則是外源基因最理想的真核生物表達係統。
近年來,隨著絲狀真菌轉化技術的迅猛發展,許多絲狀真菌被應用到工業、農業、醫藥行業中,生產出了許多真菌或非真菌來源的重組蛋白,如葡糖澱粉酶(glucoamylase)、牛凝乳酶原( bovinechymosin)、人體乳鐵蛋白( human‐lactoferrin)、雞蛋清溶菌酶( heneggwhitelysozyme)和人體白細胞介素6(humaninterleukin‐6)及甜味蛋白(thaumatin)等。
9.1酵母菌的基因工程
酵母菌的基因工程作為一個真核生物表達係統,相對於應用成熟的原核生物基因工程而言表現出一些優點,具體體現在以下幾個方麵:①基因表達調控機製比較清楚,遺傳操作相對較為簡單,並於1996年完成了對釀酒酵母基因組全序列的測定;②具有原核生物無法比擬的真核生物蛋白翻譯後修飾加工係統;③能將外源基因表達產物分泌至培養基中;④不含有特異性的病毒,不產生毒素,有些酵母菌屬(如釀酒酵母等)在食品工業中有著幾百年的應用曆史,屬於安全型基因工程受體係統;⑤大規模發酵工藝簡單而成熟,成本低廉;⑥酵母菌是最簡單的真核生物,利用酵母菌表達動植物基因能在相當大的程度上闡明高等真核生物乃至人類基因表達調控的基本原理以及基因編碼產物結構與功能之間的關係。因此,酵母菌的基因工程具有極為重要的經濟意義和學術價值。
9.1.1酵母菌的宿主係統
酵母菌的種類繁多,但不是所有的酵母菌都可以發展成基因表達係統的宿主。能夠發展成基因表達係統的宿主應具備一定的條件,如安全無毒、不致病,遺傳背景清楚、容易進行遺傳操作等。目前已廣泛用於外源基因表達的酵母菌有:酵母屬(如釀酒酵母,Saccharomycescerev isiae)、克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母,K luyveromyces lactis)、畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母,Pichia p astoris)、裂殖酵母屬(如非洲酒裂殖酵母,Schizosaccharomyces pombe)以及漢遜酵母屬(如多態漢遜酵母,H ansenula polymorpha)等。
1.釀酒酵母
釀酒酵母是最早應用於酵母基因克隆和表達的宿主菌,它具有許多宿主菌必須具備的條件,並且人類對釀酒酵母的利用有相當長的曆史,因此它的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡。
與原核細菌相比,釀酒酵母作為外源基因表達受體菌具有很多突出優點:
(1)提高重組異源蛋白的合成產物。
利用經典誘變技術篩選分離釀酒酵母的核突變株或細胞質突變株,可以提高重組異源蛋白在酵母菌中的合成產率。由於呼吸鏈缺陷型的胞質突變株很容易分離篩選,因此具有更大的實用性。例如,攜帶SSC 遺傳位點(超分泌性)的顯性突變和兩個SSC1和SSC2基因的隱性突變的釀酒酵母突變株是第一個被篩選鑒定的突變株,能提高重組異源蛋白的分泌產率。
研究表明,盡管SSC顯性突變基本上與基因的啟動子和分泌信號功能無關,但是SSC1和SSC2的隱性突變則具有一定程度的累加性,能顯著提高凝乳酶原和牛生長因子的分泌水平;而另一個突變株不僅能高效分泌重組人血清白蛋白,也可大大促進α1抗胰蛋白酶和纖溶酶原激活劑抑製因子的表達。許多突變株可提高人溶菌酶在釀酒酵母中的表達與分泌,但其影響機製也呈多樣性。例如,SS11突變株通過影響由羧肽酶催化的蛋白加工反應而提高表達產物的分泌產率;而在一個呼吸鏈缺陷的細胞質突變株(rho-)中,人溶菌酶的高效表達主要表現在轉錄水平上,而且相同的結構基因在不同的啟動子(如PGAL9、PGAPDH、PPHO5和PHIS5)控製下,均表現出不同程度的高效表達特征,也就是說,rho-突變株能促進宿主染色體和質粒上許多基因的高效表達。