一、PCR的基本原理
PCR的原理並不複雜，實際上它是在體外試管中模擬生物細胞DNA複製的過程。PCR反應極其迅速，可在短短幾小時內，將極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片段擴增上百萬倍。PCR的特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。所謂引物，就是與待擴增的DNA片段兩翼互補的寡核苷酸，其本質是ssDNA片段。在微量離心管中，除加入與待擴增的DNA片段兩條鏈兩端已知序列分別互補的兩個引物外，還需加入適量的緩衝液、微量的DNA模板、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反應時，首先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態，稱為變性；然後降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列特異配對（複性），形成部分雙鏈，稱為退火；此時，兩引物的3′相對，5′相背，在合適的條件下，以dNTP為原料，由耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）催化引導引物沿5′→3′方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作下一輪反應的模板，此即引物的延伸。如此重複改變溫度，由高溫變性、低溫複性和適溫延伸組成一個周期，反複循環，使目的基因得以迅速擴增。因此PCR是一個在引物介導下反複進行熱變性—退火—引物延伸三個步驟而擴增DNA的循環過程。
（一）模板DNA變性
模板DNA在加熱到90~95℃時，雙螺旋結構的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性。變性溫度與DNA中G-C含量有關，因為G-C之間由三個氫鏈連接，而A-T之間隻有兩個氫鍵相連，所以G-C含量高，其解鏈溫度（tm）就高。一般G-C含量每增加1%，解鏈溫度增加0.4℃。哺乳動物基因組DNA中G-C含量在40%時，tm約為87℃；其含量在60%時，tm約為95℃。DNA變性所需要的溫度和時間取決於DNA的複雜性、G-C的含量、擴增儀的種類和PCR反應的體積等。在一般PCR中，變性溫度為90~95℃，加熱時間1~2min。
（二）模板DNA與引物的退火（複性）
將反應混合物降溫（37~65℃），使寡核苷酸引物與單鏈DNA模板(或從mRNA逆轉錄而來的cDNA)上互補的序列複性，形成模板—引物複合物，即退火。退火所需要的溫度和時間，取決於引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度要大大高於模板DNA的濃度。並由於引物的長度顯著短於模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補序列配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為1~2min。
（三）引物的延伸
PCR擴增過程中，鏈的延伸是有方向性的。它總是以引物為固定起點，DNA模板-引物複合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以靶序列為模板，dNTP為反應原料，按堿基配對與半保留複製原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈，新鏈延伸的方向仍然是5′~3′，延伸所需要的時間取決於模板DNA的長度。實驗證明：迅速加入Taq DNA聚合酶2單位，混勻，置反應混合物於70℃,在酶的作用下以dNTP為原料，從引物的3′端開始，沿5′→3′方向，按照模板鏈上的序列，合成一條新的DNA鏈，其序列與模板序列互補，延伸時間決定於擴增片段的長度，新鏈合成的速度非常快，每秒可延伸40~60個堿基。
經過上述高溫變性—低溫退火—中溫延伸這樣一個循環，模板DNA拷貝數增加一倍，在以後進行的循環過程中，新合成的DNA鏈都起著模板的作用，因此，每經過一個循環，DNA拷貝數便增加一倍(×2)。n次循環後，拷貝數增加2n倍，進行25~30個循環，拷貝數即可擴增上百萬倍(106)，擴增的DNA片段長度基本上都限定在兩引物5′端以內，在凝膠電泳上顯示為一條特定長度的DNA區帶。每完成一個循環需2~4min，一次PCR經過30~40次循環，為2~3h。