引物是指與待擴增的靶DNA區段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸短片段，它通常包括引物1和引物2兩種，引物1又稱Watson引物，是5′端與有義鏈互補的寡核苷酸，用於擴增編碼鏈或mRXA鏈；引物2又稱為Crick引物，是3′端與反義鏈互補的寡核苷酸，用於擴增DNA模板鏈。兩引物在模板DNA上結合位點之間的距離決定了擴增區段的長度。實驗表明，1kb之內是理想的擴增跨度，2kb左右是有效的擴增跨度，而超過3kb就無法得到有效的擴增，而且也難以獲得一致的結果。因此，引物的選擇與合成對PCR成功與否具有決定性意義。
一、引物的選擇
位於高保守區互補的引物，可以特異性擴增某一目標DNA，可用於目標基因的分離或鑒定(而隨機引物可導致多區域擴增)，產生特征性PCR擴增指紋圖譜，從而用於快速基因分型。
待擴增的目標DNA不同，使用的引物也不相同。常用的引物選擇方法有三種：一是根據文獻選擇，文獻作者已使用過某對引物，並對其進行了靈敏度、特異性、循環參數、反應條件等諸多研究，可直接引用其序列，合成後作PCR擴增，此法的成功率很高；第二種方法是根據文獻的DNA序列或基因數據庫(如EMBL數據庫)查詢的DNA序列自行設計引物；第三是對獲得的目的DNA片段作核苷酸分析，然後自行設計引物。
二、引物設計的原則
引物設計的總原則是：提高特異性擴增，抑製非特異性擴增。主要標準如下。
（1）長度應為15~30bp，一般為18~24bp，與模板順序互補。引物的有效長度［Ln=2(G+C)+(A+T)］不能大於38，因Ln>38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度(74℃)，不能保證產物的特異性。
（2）堿基隨機分布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，避免嘌呤、嘧啶一連串堆積。尤其在3′端不應超過三個連續的G或C，以免引物在G+C富集序列區錯誤引發。
（3）G+C含量在40%~60%間，以45%~55%為宜，太少擴增效果不佳，G、C過多易出現非特異條帶。引物的Tm是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動溫度(tp)一般高於tm5~10℃。tm可以用公式簡單地計算。
有效引物的tm應為55~80℃，其tm最好接近72℃，以使複性條件最優。
tm=4(G+C)+2(A+T)
（4）引物本身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構或引物本身複性，引物本身互補序列不能連續超過三個堿基；避免引物內部出現二級結構，因這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的複性結合。