一、PCR反應體係的組成
（一）模板
作為PCR模板的核酸標本來源廣泛，用於提取核酸的材料種類可能差異很大，如1000多萬年前的木蘭科葉子化石、已滅絕動物皮中發現的肌肉、單根人類毛發和石蠟包埋的活組織標本等；也可以從培養的細胞和微生物中提取。雖然大多數PCR對模板的要求不高，純度要求也不嚴，用量也低，待擴增核酸仍需要部分純化，以除去核酸標本中的蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑製物以及能結合DNA的蛋白。純化核酸的目的主要在於：①除去雜質，特別是除去幹擾Taq酶活性的物質；②使待擴增的靶序列DNA暴露和濃縮，從而保證有足量的DNA模板啟動PCR反應；③有利於評價擴增體係的靈敏度，並根據產物對靶DXA進行定量分析。
提取DNA的基本過程是在EDTA存在的條件下，用蛋白酶K及SDS裂解細胞，消化蛋白質，使核蛋白解聚及胞內DNA酶失活；然後用酚、氯仿多次抽提以去除蛋白質，在DNA中若混有少量RNA，可用RNA酶去除；最後用乙醇沉澱得到DNA：在提取中應盡量保持DNA完整性和純度，防止DNA降解。被擴增的DNA特定序列不需要事先從樣品DNA中分離，因為PCR產物的序列，即反應的特異性是由寡核苷酸引物所決定的。單、雙鏈DNA和RNA都可作為PCR的模板，如果起始模板為RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA鏈後才能進行PCR擴增。理論上，PCR可以擴增極其微量的核酸樣品（甚至是單個細胞的DNA），但是為了保證反應的特異性，PCR反應中的模板加入量一般為102~105個拷貝靶序列，即一般宜用ng量級的克隆DNA，μg級的染色體DNA或104倍的待擴增片段來做起始材料，人類基因組DNA 1μg相當於3×105個單拷貝靶分子，大腸杆菌DNA 1ng相當於3×105個單拷貝靶分子。因此擴增不同拷貝數的靶序列時，加入的含靶序列的DNA量也不同。另有資料認為，用小分子質量和線性模板DNA擴增效果較好。因此當使用極高分子質量的DNA（如基因組DNA）時，可以使用低頻率切點的限製酶（如NotI或SatI）先進行消化，再作擴增效果好；閉合環狀質粒作PCR模板時最好先線性化處理，以提高擴增效率。
（二）引物
一般PCR反應中每條引物的濃度為0.1~1.0mol/L，在此範圍內PCR產物量基本相同。引物濃度過低則PCR擴增產量降低，引物濃度過高又會促進引物的錯誤引導，導致非特異擴增，還會增加引物二聚體的形成，非特異產物和引物二聚體又可作為PCR反應的底物，與靶序列競爭DNA聚合和dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低，且不經濟。實驗證明，低濃度引物不僅經濟而且特異性好。
（三）dNTP
dNTP是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的總稱，dNTP儲存液必須為pH7.0左右，其濃度一般為2mmol/L。dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關係。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度儲存液後，以1mol/L的NaOH或1mol/L的Tris-HCl緩衝液將其pH調節到7.0～7.5，最初的儲存液可稀釋到10mol/L，小量分裝後於-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。PCR反應體係中，每種dNTP的終濃度為50~200μmol/L，在此範圍內，擴增產物量、特異性與合成忠實性之間的平衡最佳。dNTP濃度過高會引起錯誤摻入，過低又影響產量。理論上，100μL反應液中兩種dNTP的濃度為20μmol/L時，足以合成12.5μgDNA或合成10pmol 400bp的DNA片段。四種dNTP的終濃度應該相同，任何一種的濃度明顯偏高或偏低時，都會導致鏈延伸時的錯誤摻入增加，過早終止合成反應。如在100μL的反應體係中，4種dNTP的濃度為20μmol/L可基本滿足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。另外，dNTP的類似物也可加入PCR反應體係中，如5-溴化脫氧尿嘧啶、生物素化脫氧尿嘧啶核苷或地高辛化脫氧尿嘧啶核苷，與dNTP的比例以1∶3加入，生成的PCR產物即為非放射性標記的核酸探針，用於核酸探針雜交試驗。
dNTP會絡合溶液中的Mg2+，而且大於200μmol/L的dNTP會增加Taq DNA聚合酶的錯配率。如果dNTP的濃度達到1mmol/L時，則會抑製Taq DNA聚合酶的活性。