免疫熒光分析(Immuno Fluorescence Assay，IFA)始創於20世紀40年代初，1942年Coons等多次報道用異硫氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，當時由於此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至20世紀50年代末期，Riggs等(1958)合成性能較為優良的異硫氰酸熒光黃。Mashall等(1958)對熒光抗體的標記方法又進行改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。免疫熒光細胞化學技術是采用熒光素標記的已知抗體(或抗原)作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原(或抗體)，形成的抗原抗體複合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由於受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質，並可利用熒光定量技術計算抗原的含量，以達到對抗原物質定位、定性和定量測定的目的。
一、基本原理
抗體與熒光素結合後，並不影響其和相應抗原發生特異性結合反應，事先將待測抗原固定於載玻片上，滴加熒光標記抗體，若熒光標記抗體與相應抗原發生特異性結合反應，不能被緩衝液衝掉，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩衝液衝掉，在熒光顯微鏡下觀察不到熒光。
二、抗體的熒光標記
熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量後，即刻引起發光；停止能量供給，發光也瞬即停止。熒光素是一種能吸收激發光的光能產生熒光，並能作為染料使用的有機化合物，也稱熒光色素。目前用於標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。
（一）熒光抗體的製備
用於標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經純化提取IgG後再作標記。作為標記的熒光素應符合以下要求：①應具有能與蛋白質分子形成共價鍵的化學基團，與蛋白質結合後不易解離，而未結合的色素及其降解產物易於清除；②熒光效率高，與蛋白質結合後，仍能保持較高的熒光效率；③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明；④與蛋白質結合後不影響蛋白質原有的生化與免疫性質；⑤標記方法簡單、安全無毒；⑥與蛋白質的結合物穩定，易於保存。
常用的標記蛋白質方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC標記為例，攪拌標記法為：先將待標記的蛋白質溶液用0.5mol/L pH 9.0的碳酸鹽緩衝液平衡，隨後在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續攪拌4～6h後，離心，上清即為標記物。此法適用於標記樣品量較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較強的非特異性熒光染色。
透析法適用於標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質溶液裝入透析袋中，置於含FITC的0.01mol/L pH 9.4碳酸鹽緩衝液中反應過夜，以後再用PBS透析法去除遊離色素。低速離心，取上清液。
標記完成後，還應對標記抗體進一步純化，以去除未結合的遊離熒光素和過多結合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或層析分離法。
（二）熒光抗體的鑒定
熒光抗體在使用前應加以鑒定。鑒定指標包括效價及熒光素與蛋白質的結合比率。抗體效價可以用瓊脂雙擴散法進行測定，效價大於1∶16者較為理想。熒光素與蛋白質結合比率（F/P）的測定和計算的基本方法是：將製備的熒光抗體稀釋至A2801≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰，按公式計算。
(FITC)F/P=2.87×A495A280-0.35×A495
(RB200)F/P=A515A280
F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用於固定標本染色的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用於活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。