酶免疫實驗技術是20世紀60年代在免疫熒光和組織化學基礎上發展起來的一種新技術，最初是用酶代替熒光素標記抗體作生物組織中抗原的鑒定和定位。隨後發展為用於鑒定免疫擴散及免疫電泳板上的沉澱線。到1971年，Engvall等用堿性磷酸酶標記抗原或抗體，建立了酶聯免疫吸附測定（ELISA），這一技術的建立被認為是血清學實驗的一場革命，是目前令人矚目的有發展前途的一種新技術。
一個抗體分子與靶抗原結合之後，形成的抗原抗體複合物肉眼是不可見的，如將抗體(或抗原)與某種顯色劑偶聯，抗原與抗體結合形成的複合物就由不可見而成為可見，從而可以確定樣品中是否存在某種抗原(或抗體)。酶免疫技術就是用酶(如辣根過氧化物酶)標記已知抗體(或抗原)，然後與樣品在一定條件下反應，如果樣品中含有相應抗原(或抗體)，抗原抗體相互結合形成的複合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以定性、定量測定樣品中的抗原(抗體)。酶免疫技術發展迅猛，種類繁多，酶免疫技術分為酶免疫組化技術和酶免疫測定技術，酶免疫測定技術又分為均相酶免疫測定和異相酶免疫測定技術，異相酶免疫測定技術又分為固相酶免疫測定技術和液相酶免疫測定技術（參考免疫學教材），本節主要討論應用最廣泛的固相酶免疫測定技術中的酶聯免疫吸附測定技術。
一、基本原理
酶聯免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 簡稱ELISA)是在酶免疫技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術,其基本原理是抗體（抗原）與酶結合後，仍然能和相應的抗原（抗體）發生特異性結合反應，將待檢樣品事先吸附在固相載體表麵稱為包被，加入酶標抗體（抗原），酶標抗體（抗原）與吸附在固相載體上的相應的抗原（抗體）發生特異性結合反應，形成酶標記的免疫複合物，不能被緩衝液衝掉，當加入酶的底物時，底物發生化學反應，呈現顏色變化，顏色的深淺與待測抗原或抗體的量相關，借助分光光度計的光吸收計算抗原（抗體）的量，也可用肉眼定性觀察，因此可定量或定性的測定抗原或抗體。
二、ELISA的種類
ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法。
（1）直接法測定抗原
A.將待測抗原吸附在載體表麵；
B.加酶標抗體，形成抗原－抗體複合物；
C.加底物，底物的降解量與抗原量呈正相關。
（2）間接法測定抗體
A.將抗原吸附於固相載體表麵；
B.加待測抗體,形成抗原-抗體複合物;
C.加酶標二抗（抗抗體）；
D.加底物，底物的降解量與抗體量呈正相關。
（3）雙抗體夾心法測定抗原
A.將已知特異性抗體吸附於固相表麵;
B.加待測抗原，形成抗原-抗體複合物;
C.加酶標抗體形成抗體－抗原－抗體複合物;
D.加底物，底物的降解量與抗原量呈正相關。
（4）競爭法測定抗原
A1、A2、A3將抗體吸附在固相載體表麵;
B1加入酶標抗原；
B2、B3加入酶標抗原和待測抗原；
C1、C2、C3加底物，樣品孔底物降解量與待測抗原量呈負相關。
三、抗體的酶標記
用於免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用於ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由於酶催化的是氧化還原反應，在呈色後須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。辣根過氧化物酶交聯在抗體上的方法主要有兩種，即戊二醛法和過碘酸氧化法。
（一）戊二醛法戊二醛作為雙活性試劑可將酶與抗體交聯在一起，但戊二醛與蛋白質反應的機理各說不一，有的認為可能形成Michael加合物，也有人認為可能是產生不飽和醛，再與—NH2反應成雙Schiff堿蛋白衍生物。
戊二醛交聯法有一步法和二步法之分。一步交聯法是把一定量的酶，抗體和戊二醛同加入溶液中，在一定溫度下反應一段時間，然後用透析法或凝膠過濾除去未結合的戊二醛即可得到酶結合物。在蛋白質與戊二醛的交聯反應中，蛋白質賴氨酸基團是戊二醛最可能的反應部位，組成辣根過氧化物酶（HRP）的300多個氨基酸中隻有6個賴氨酸。市售的HRP中，隻有1～2個賴氨酸基團可供交聯，而抗體分子中，賴氨酸基團含量要大得多，因此在一步交聯中，HRP反應性不強，抗體分子在戊二醛作用下易形成聚合物，因此交聯反應後必須用50％飽和硫酸銨沉澱或用凝膠過濾除去聚合物。一步法酶結合物產率僅6％～7％，其中HRP約占5％。在正常情況下，HRP隻有一個戊二醛分子的一個醛基反應，而第二個醛基不能與同一個或其他酶反應，即不發生聚合，故可將戊二醛先與HRP反應，透析除去未反應的戊二醛，再加入抗體，這樣就不會產生聚合現象，此為二部交聯法。產生的酶結合物中，其酶和抗體的物質的量的比接近1∶1，標記活性的損失比一步法少，但該法效率也不高，僅有2％～5％的HRP標記在抗體分子上，標記的抗體隻占25％，酶結合物的產率僅為10％～15％。在實際運用中，酶與抗體物質的量比在1～2之間為宜，但未標記的抗體嚴重幹擾檢測結果，常用聚丙烯酰胺－瓊脂糖凝膠(Ultrogel ACA-4A)過濾法除去未標記的抗體，如無上述凝膠，也可用Sephadex G-200代替。
（二）過碘酸鹽氧化法
辣根過氧化物酶是一種帶糖的酶。糖含量約占18％，過碘酸鹽可將糖中的羥基氧化成醛基，再與抗體直接連接。然後加硼氫化鈉還原形成穩定的酶結合物。該法交聯效果比戊二醛法好，結合物中HRP與抗體的物質的量的比在2～3之間，參與酶結合物中的HRP可達70％，而抗體則可達99％。但在標記過程中，酶活性和抗體的免疫活性損失較多。
用戊二醛交聯時，戊二醛的質量至關重要。戊二醛易揮發，久置可發生聚合和氧化，降低交聯作用。由於戊二醛單體的光吸收峰是280nm，而聚合體則在235nm，故新鮮的、保存得法的戊二醛，其A235nmA280nm的比值小於3。戊二醛應避光、低溫保存。辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區作輔基。
純度RZ（Reinheit Zahl）值越大，說明酶內所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達3.4。用於ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。
四、酶與底物
酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯劑作用下聯結的產物，是ELISA成敗的關鍵試劑。它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。最常用的酶是辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶常用的底物是OPD,但OPD有致癌作用，顯色也不穩定，因此近年來人們更願意用性質穩定又無致癌作用的TMB作為辣根過氧化物酶的底物。
其中，AH2為無色底物,供氫體；A為有色產物。
五、固相載體
可作ELISA中載體的物質很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上後保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可製成各種形狀，在ELISA測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學反應，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板（酶標板）。小試管的特點是還能兼作反應的容器，最後放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表麵經磨砂處理後吸附麵積增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應板，專用於ELISA測定的產品也稱為ELISA板，國際通用的標準板形是8×12的96孔式。為便於作少量標本的檢測，有製成8聯或12聯孔條的，放入座架後，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，並可在特定的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用於微量反應板型的ELISA檢測，加樣、洗滌、保溫、比色等步驟皆可實現自動化，對操作的標準化極為有利。