放射免疫分析（Radio Immunoassay，RIA）是以放射性核素為標記物的標記免疫分析法，是由Yalow和Berson於1960年創建的標記免疫分析技術。由於標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達ng甚至pg水平。測定的準確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用於微量蛋白質、激素和多肽的精確定量測定，是定量分析方麵的一次重大突破，於1977年榮獲諾貝爾生物學醫學獎。
一、基本原理
放射免疫分析的基本原理是標記抗原Ag*和非標記抗原Ag對特異性抗體Ab的競爭結合反應。
在這一反應係統中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的。抗體的量一般取用能結合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據標本中抗原量的不同，得到不同的反應結果。
當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在於一個反應係統時，由於標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭結合特異性抗體。由於標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體複合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結合較多的抗體，從而抑製標記抗原對抗體的結合，使標記抗原抗體複合物相應減少，遊離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體複合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比。若將抗原抗體複合物與遊離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算出結合態的標記抗原（B）與遊離態的標記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結合率[B/(B＋F)]，這與標本中的抗量呈函數關係。用一係列不同劑量的標準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪製出一條劑量反應曲線。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。
二、放射免疫測定技術的種類
放射免疫測定法可分兩大類，即液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。液相放射免疫測定需要加入分離劑，將標記抗原抗體複合物B和遊離標記抗原F分離，而固相放射免疫測定測試程序簡單，通常無需離心操作。即使沒有經過嚴格訓練的工作人員，在采用固相分離方法進行測定時，也很少產生分離誤差。因此，SPRIA是體外放射免疫發展的主要方向。液相放射免疫測定的基本過程為：①適當處理待測樣品；②按一定要求加樣，使待測抗原與標記抗原競相與抗體結合或順序結合；③反應平衡後，加入分離劑，將B和F分開；④分別測定B和F的脈衝數；⑤計算BF、B%等值；⑥在標準曲線上查出待測抗原的量。固相放射免疫測定是將抗體吸附在固相載體上分競爭性和非競爭性。競爭性又分為單層競爭法、多層競爭法，非競爭性又分為單層非競爭法和多層非競爭法。
(一)單層競爭法
預先將抗體連接在載體上，加入標記抗原（*Ag）和待檢抗原（Ag）時，二者競爭與固相載體結合。若固相抗體和*Ag的量不變，則加入Ag的量越多，B/F值或B%越小。根據這種函數關係，則可作出標準曲線。
（二）雙層競爭法
先將抗原與載體結合，然後加入抗體與抗原結合，載體上的放射量與待測濃度成反比。此法較繁雜，有時重複性差。
（三）單層非競爭法
先將待測物與固相載體結合，然後加入過量相對應的標記物，經反應後，洗去遊離標記物測放射量。即可算出待測物濃度。本法可用於抗原、抗體，方法簡單，但幹擾因素較多。
（四）雙層非競爭法
預先製備固相抗體，加入待測抗原使成固相抗體－抗原複合物，然後加入過量的標記抗體，與上述複合物形成抗體－抗原－標記抗體複合物，洗去遊離抗體，測放射性，便可測算出待測物的濃度。與ELISA的雙抗體夾心法相似。
三、抗體的同位素標記
（一）標記物
標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；後者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。兩者相比，1mol125I或14C結合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易於標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。
（二）標記方法
標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。
直接標記法是將125I直接結合於蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上。此法優點是操作簡便，為125I和蛋白質的單一步驟的結合反應，它能使較多的125I結合在蛋白質上，故標記物具有高度比放射性。但此法隻能用於標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。