分子標記技術用於藥用植物研究隻是最近10多年的事,目前從事這方麵工作的研究人員主要是在中國內地、中國香港、中國台灣以及日本。研究範圍則主要是藥用植物真假鑒定及品種分類。香港中文大學邵鵬柱實驗室率先將分子標記技術用於中藥材的鑒定研究。
1994年,他們首次報告利用Ap-PCR技術對人參及西洋參進行了鑒定研究。次年,他們又報道利用RAPD技術對真假人參進行分析鑒定。隨後,他們利用RAPD、Ap-PCR、ITS測序等技術對多種藥用植物(如菖蒲、淫羊藿、地膽草、蒲公英、杜鵑蘭、黨參、八角蓮等)的藥材及其替代品或偽品進行了分子鑒定。結果表明,這些分子標記技術能夠比較有效地應用於藥用植物(包括商品中藥材)的真假鑒定。盡管也可以將解剖學、組織學和化學方法運用於生藥鑒定,但這些方法仍有較大的局限性。比如一些生藥的粉末鑒定,可以借助於導管、篩管、澱粉粒等性狀來鑒別。然而,許多植物的這些性狀非常相似,而且這些性狀在藥材的不同部位有一定區別,因此,在藥材鑒定時仍有較大困難。分子標記技術在藥用植物鑒定方麵的成功運用,將有助於對那些較難從一些感性特征甚至是解剖學或組織學上進行有效真假鑒別的中藥材實現在DNA分子水平上的輔助鑒定。
中藥材大多是藥用植物的某一器官經過炮製加工而成的,由於藥用植物之間存在大量的近緣種、易混淆品種、珍稀品種,再加上近年來中藥材市場上出現的以次充好、以劣充優、尋找廉價替代品的現象,使得中藥材的分類、鑒定等工作顯得十分重要。如何將先進的分子生物學技術與傳統藥用植物的研究結合起來,是實現藥用植物研究現代化的重要途徑。隨著分子生物學技術特別是分子標記技術的發展,分子標記技術在藥用植物的相關研究中得到了廣泛的應用,是現代生物技術與傳統中草藥研究相結合的一個重要的嚐試和實踐。分子標記技術在中草藥植物的研究中的運用主要體現在以下的幾個方麵。
一、種質資源鑒定
(一)分子標記在藥用植物分類上的應用
植物分類學發展至今,分類的手段得到了極大的發展,運用這些不同的技術手段和分析儀器發展了多種有關的植物分類學科,包括實驗分類學、細胞分類學、化學分類學、數量分類學等。經典的植物分類是采用植物形態學及解剖學的方法,從植物的外部形態及組織構造來劃分植物不同的屬、種、亞種以及不同的植物類群。對於中草藥植物的分類而言,我國古代的本草著作《本草綱目》和《植物名實圖考》就是采用了這些植物的基本形態特征開展對中草藥植物的分類。利用經典的分類方法對中草藥進行分類取得了巨大的成就。但是傳統的分類方法也有其局限性。采用的經典形態分類學方法區分不同的物種是建立在個體性狀描述的宏觀觀測水平上,所采用的形態分類在分類的標準上比較有限、數值上難於量化,容易引起比較大的爭議,同時要求分類者具有十分豐富的實踐經驗。
另外一種較為常用的植物化學分類方法是通過研究植物的化學成分來探討植物間的演化及親緣關係,這種化學的分析分類方法在一定的意義上是能夠反映植物分類的,但是也具有不足之處。以化學分類方法而言,由於植物在生長過程要受到外界環境因素的作用,同一種植物處於不同的條件下其外部形態、組織構造乃至化學成分都會有所改變,因此依靠這些方法來劃分植物類型具有很大的局限。DNA作為植物的遺傳物質,具有穩定、可靠、不受外界因素影響的特點,將分子標記技術應用於中草藥植物的分類研究開始於20世紀90年代。分子標記的應用給中草藥植物分類學研究帶來了廣闊的前景,具有十分深遠的意義。
1.分子標記在藥用植物種屬分類上的應用的主要表現
目前利用不同種類的分子標記開展中草藥植物的種屬分類工作取得了很大的進展,主要表現在以下幾個方麵。
(1)采用的分子標記多種多樣,既有RFLP標記、SSR標記,也有RAPD等其他類型的分子標記,但是以RAPD標記比較多見。
(2)所涉及的中草藥植物總計達到近百種之多,已經深入到中草藥分類學研究的各個方麵。對於不同的中草藥不同種的分類來講,利用分子標記技術不僅可以對分析結果進行聚類分析,而且可以獲得與種有關的DNA帶型。以貝母的分類研究為例:卞雲雲等用RAPD法對12個貝母類藥材品種進行親緣關係的研究,發現引物OPF-206(OPF代表美國OPERON公司的編號,是隨機引物組合中的第F組)擴增的片斷在貝母屬各樣品間無明顯差異,表明OPF-206擴增片段在貝母內具有高度穩定性,可作為貝母屬的特征性片段。而引物OPF-205的擴增產物在貝母品種間有明顯不同,有可能成為鑒定貝母品種的標記。
(3)利用分子標記對中草藥進行分類可以驗證傳統分類學的結果,同時也可以增加一些新的信息。以豆科黃芪亞族及甘草亞族的分類為例:丁士友等用PCR反應將豆科黃芪亞族7屬9種及甘草亞族1屬1種植物葉綠體基因組中ndhF和psbA基因中一段約3.1kb的DNA擴增出來,並摸索出最佳的PCR反應條件,使得此條帶得以特異性擴增,通過對此擴增片段的限製性片段長度多態性(RFLP)的初步分析,結果表明在同一屬不同種間,大多具相同的酶切位點,突變較少,而在同一亞族不同屬間,存在較多的不同位點突變,亞族間的植物則具有更多的位點差異,這些酶切位點的異同和多少與用經典方法所得的這些類群間的親緣關係基本一致。
2.在藥用植物種屬分類上的應用實例
(1)以小檗科植物分類為例王艇等利用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術分析了小檗科(Berberidaceae)5個屬6種植物:貓兒刺(BerberisjulianaeSchneid)、日本綠葉小檗(BetberisthunbergiiDC.)、闊葉十大功勞[Mahoniabealei(Fon.)Carr.]、南天竹(NandinadomesticaThunb.)、淫羊藿[Epimediumsagittatum(S.etZ.)Maxim.]和八角蓮[Dysosmaversipellis(Hance)M.Cheng]。經過對Sangon公司的60個引物的初步篩選,其中29個引物為多態性引物。采用UPGMA法對求出的遺傳距離進行聚類分析,結果顯示日本綠葉小檗與貓兒刺可以歸為小檗屬,另外的4個種可以歸為一個組,並建議在小檗科內建立十大功勞屬(Mahonia)和南天竹屬(Nandina)。
(2)以銀杏的分類為例銀杏(GinkgobilobaL.)為單科屬植物,是一種“活化石”。銀杏在長期的栽培和引種馴化的過程中,由於長期的天然雜交和人工選擇,銀杏的種子和葉片與原始隔離狀態的銀杏種群發生了明顯的變異,根據這些變異,有的學者在種之下劃分了變種、變型和類型。不同的學者從不同的變異角度考慮就有不同的品種劃分。Cartiere等根據銀杏冠形和枝、葉形態、葉的大小和顏色將銀杏劃為8個種;曾勉根據銀杏種子大小和形狀將銀杏分為3個變種;何鳳仁根據銀杏種核的長度比例和兩個中軸線交會點的位置劃為5大類,每類包括若幹品種。產生這些分類的差異是由於不同的分類者采用了不同的形態學標準所造成的,但是這些在利用形態學上進行分類的差異和分歧有望通過利用分子標記手段和傳統的形態學手段相結合的方式加以解決。
又比如川貝母(FritillariacirrhosaD.Don),隸屬貝母屬(Fritillaria)貝母組(SectFritilliaria),自李培元1966年發表了第1個與川貝母接近的名稱太白貝母(F.taipaiersis)外,國內有不少學者先後發表了36個與川貝母相近名稱,形成十分龐大的複合群。後來的學者根據其地理分布及一些形態特征,將它們劃分為4個種:川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、華西貝母(F.sichuanica)、太白貝母(F.taipaiersis)及榆中貝母(F.yuzhonnesis)。但是川貝母複合群分布範圍廣,變異十分複雜,葉先端卷曲與否,葉狀包片數目,花被片顏色,斑塊多少,花被片形狀等的變異規律還遠未研究清楚,因此僅靠其外部形態特征來劃分種還有待進一步的分析和研究。
(二)植物藥材的真偽鑒別
由於植物藥材在經過加工以後不同藥材之間的差異在形態上很難區分。要鑒別一種藥材的真品和偽品往往要經過形態觀察、顯微鑒定和理化分析等多個步驟。而藥材的偽品往往是真品的同一個屬(種)的不同種(亞種)等,要利用傳統的分析方法鑒定這些不同種的藥材(偽品)有一定的困難。而分析不同種或者亞種之間的差異恰恰是分子標記的優勢所在。利用分子標記開展藥材的真偽鑒定已經取得了一定的進展。1994年邵鵬柱等首次報道了對中藥材人參與西洋參采用AP-PCR標記進行鑒別,他們采用20、24個堿基引物作為PCR反應的引物成功地利用AP-PCR指紋圖譜技術鑒定出人參和西洋參。1995年分離人參屬3種植物人參(PanaxginsengC.A.Mey)、西洋參(P.quinquefoliusL.)、三七(P.notoginseng)和4種偽品包括桔梗、紫菜莉、櫨蘭、商陸的基因組DNA,分別采用10個堿基的OPC25和OPC220作引物,用RAPD標記可以明顯地區別人參屬3個品種和人參及其偽品。