再比如,我國南方部分省區有多種菊科不同屬的植物如地膽草、一點紅、苦蕒菜、毛大子草、山萵苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用,僅從形態上很難鑒別。曹暉等利用AP-PCR和RAPD分子標記技術對蒲公英及6種土公英混淆晶進行了DNA指紋鑒別研究,結果顯示它們的DNA指紋圖譜存在明顯差異,利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品。KohjyoumaM等采用CTAB法提取菊科蒼術屬5種植物茅蒼術、北蒼術、單葉蒼術、關蒼術和白術等新鮮葉片組織的基因組DNA,利用RAPD技術獲得了清晰的多態性DNA指紋圖譜,能明顯地區分蒼術的幾個品種,發現在基因水平上單葉蒼術與茅蒼術十分接近,而與白術和關蒼術相距較遠,後兩者與北蒼術又相近似。
黃豐等根據RAPD指紋圖譜的不同,準確地鑒定了西紅花及其偽冒品。薑科薑黃屬植物種類繁多(全世界約有60多種,我國也有10多種),常用藥材鬱金、莪術和薑黃等都來源於該屬。但它的分類、名稱及其與商品藥材的關係一直比較混亂。肖小河等對薑科薑黃屬10個種進行了RAPD分析,結果說明基於RAPD多態性的數值分類從分子水平上為研究薑黃屬遺傳背景差異及植物分類與鑒定提供了依據。此外,淫羊藿屬8種植物、雲南8種木藍屬植物、山冬麥屬4種植物等用RAPD技術也得到了準確的鑒定。
(三)中草藥的道地性分析
中草藥具有強烈的地域性特征,稱之為“道地性”。藥材“道地性”通常包括以下幾個方麵的內容:①具有比較悠久的曆史,運用比較廣泛。②往往分布在某些特定的區域。③藥材的質量最好、療效佳、產量大。
藥材“道地性”產生的一個根本的原因就是植物的遺傳物質DNA、或者與初生和次生代謝物合成有關的酶係統受到當地的氣候、環境因素的影響,發生了“道地性”變化,從而使得植物體內的初生和次生代謝產物含量與其他地區或者類群的同類植物具有顯著性的差異。如柴胡中的柴胡皂苷含量、芍藥的芍藥苷含量均隨產地、采收季節的變化而變化。
道地性藥材與非道地性藥材通常是屬於同一個種,甚至同一亞種,兩者在形態和生藥性狀等特征上,差別往往不明顯,因而給道地藥材的鑒別帶來了困難。鑒定藥材的“道地性”是近年來中草藥研究的一個重要方麵。因此,采用DNA分子診斷技術並輔以同工酶技術和形態學分析,可以從分子水平上來揭示藥材的“道地性”。
當歸為傘形科多年生草本藥用植物,根部含有槁本內酯、阿魏酸等多種有效成分,具有補血活血、潤燥滑腸之功能。當歸主產區為甘肅省,一般認為甘肅岷縣為其道地產區,但甘肅省宕昌、武都、漳縣以及四川省南坪的當歸也可以作為藥用。高文遠、秦恩強等對來自當歸不同產區的18個樣品,采用RAPD法對其基因組DNA進行了分析,並結合聚類分析定性定量地探討了不同產區(居群)的18個當歸樣品的基因組DNA多態性。結果顯示地理分布距離越小,當歸的遺傳差異越小,反之越大。但生態環境特別是小生境對當歸遺傳差異的作用亦不可忽視。利用相同的分析方法,已經將不同的分子標記運用到包括枸杞(LyciumbarbarumL.)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、當歸(AnagelicasinensisDiels)、厚樸(MagnoliaoffcinalisRehd.etWils)、薑黃(CurcumalongaL.)、冬蟲夏草[Cordycepsinensis(Berk.)Sacc.]等藥用植物道地性的研究之中。在分子水平上證實了中藥材的道地性與遺傳變異和地理環境都有密切的聯係。
但是,藥材的“道地性”分子標記研究仍然存在著幾個問題需要解決。第一,道地性藥材的取樣的代表性問題:鑒別中草藥的道地性的首要的一個原則是哪種藥材是真正的“道地”藥材。在傳統的中草藥記載之中,往往將某個地區的某類中草藥作為其道地藥材。但事實上,由於該地區的地域較廣,以該地區的具體居群、何時采收的何種部位的藥材作為道地研究的標準還不是十分的明確。第二,道地性藥材的分子標記與藥材的有效成分的含量問題。分子標記研究為藥材道地性形成機製的研究提供了一些依據,但有關如何將分子標記、藥材道地性與有效成分及其含量三者的有機聯係的研究結果十分少見。厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.etWils)是我國特有中藥材,來源於厚樸學名及其變種凹葉厚樸學名。商品厚樸按產地分為川樸和溫樸,一般認為川樸最好,溫樸次之,而其他產地的質量更差。以往的研究表明,厚樸不同來源的藥材中厚樸酚的含量差異很大,而且受采收部位、生長年限、樹皮厚度及貯藏時間等的影響,因而以往研究的結果對闡明道地性與含量之間關係的參考意義有限。分子標記的研究發現了分子標記與厚樸酚的含量正向相關關係,道地性與遺傳因素相關,但有關何種分子標記決定厚樸酚的含量並沒有更為深入的報道。
(四)中藥材基原植物的鑒定
中草藥的基原鑒定是應用動植物學的分類知識,對藥材的來源進行鑒定研究,確定其正確的學名,以保證應用品種的準確無誤。中藥材和中藥飲片的基原與品質直接關係到中醫臨床組方的安全有效,也影響著中藥新藥的質量標準化以及中醫藥現代化、國際化。
曹暉等以CTAB微量提取法分離菊科植物地膽草、白花地膽草和假地膽草以及4種商品苦地膽藥材的基因組DNA,采用長引物Mbforward(24個堿基),GalK(20個堿基)進行AP-PCR擴增和用OPC26(10個堿基)的短引物進行RAPD擴增,獲得清晰可靠的DNA指紋圖譜,根據DNA帶型差異鑒別出地膽草及其混淆品。同時通過對DNA指紋圖譜的相似度指數值計算,證實4種商品藥材苦地膽的基原為菊科植物地膽草。
Yamazaki等采用酸性緩衝液提取法分離了4種豆科甘草屬植物光果甘草、甘草、刺毛甘草和刺果甘草的基因組DNA,通過RAPD指紋圖譜分析,表明光果甘草與甘草遺傳關係非常接近,刺毛甘草和刺果甘草的遺傳關係相距較遠,這種結果與RFLP所得結果類似,也與植物分類學研究吻合。他們進一步對4種商品甘草藥材(新疆甘草、西北甘草、西伯利亞甘草、阿富汗甘草)采用RAPD方法作遺傳距離估算,來對其進行基原鑒別,逐步證實了阿富汗甘草來源於光果甘草、西伯利亞甘草來源於甘草、新疆甘草和西北甘草來源於刺果甘草。
(五)複方製劑、粉劑中藥材的成分分析
中藥材複方製劑、粉劑等由於其中的各種生藥外觀性狀完全遭到破壞,要了解某味藥是否存在,用傳統的鑒定方法往往難以奏效,故有“丸散膏丹,神仙莫辨”的說法。
分子標記技術的出現為複方製劑、粉劑中藥材的鑒定帶來了十分重要的工具,也是分子標記在中藥材研究之中最無爭辯之處。從理論上來講,隻要能夠獲得某種藥材的高度特異性的帶型即可達到鑒定的目的。以RAPD標記為例,如果隻要能夠獲得該種藥材的高度特異性的寡核苷酸引物就可以達到鑒定的目的。
Ozeki等采用異硫氰酸胍微量提取法分離人參屬3種植物人參、西洋參和竹節參以及兩種人參製劑高麗紅參泡茶和OTANECHAN(日本的一種人參組織培養物製成的茶)的基因組DNA,通過RAPD分析,結果發現人參的根毛組織和幹燥藥材產生相同的RAPD指紋圖形,人參、西洋參和竹節參之間采用不同的引物產生不同的RAPD指紋圖;高麗紅參泡茶中幾乎沒有DNA片段擴增,但從OTANECHAN中擴增到了與人參愈傷組織相同RAPD指紋的DNA片段。這表明了RAPD技術應用於中藥傳統製劑中組分鑒別的可能性。
黃璐琦等對來源於13個種3個變種的天花粉及其類似晶共26份樣品,用8個擴增多態性好的引物分別進行擴增,得到清晰、穩定的條帶83條。然後采取聚類分析的方法,結果表明全部樣品可被有效地分為3大類:第1類是大宗商品和小宗商品;第2類是天花粉藥材商品中極易混淆的湖北栝樓根和紅花栝樓根;第3類全部是混淆晶和地區習慣用藥。對不同植物來源的天花粉,尤其是對來自不同組或組上水平的天花粉采用RAPD技術能夠很好地把它們區別開來,其結果與物種間的親緣關係基本一致。這為解決粉末及破碎藥材的鑒定問題提供了新的方法。
此外,分子標記技術還可以應用於動物藥材的鑒定。利用分子標記技術開展動物藥材的鑒定通常要解決兩個問題:①要求有藥材的原動物的基因組DNA作為對照分子。②要求有一套有效抽提動物藥材DNA方法。在解決上述難題以後有關分子標記技術同樣適用於動物藥材的鑒定。劉向華等分別從藥材蛇膽的膽衣和膽汁、原動物棕黑錦蛇的肌肉和膽汁中提取DNA,經PCR擴增得到約400bp的12SrRNA基因片段,並對該基因片段進行測序研究。擴增產物的測序結果表明同一動物的膽衣和膽汁、肌肉和膽汁的堿基序列完全一致。在動物藥研究中,Hashimoto等用PCR方法擴增了鹿茸、蝮蛇和海馬的12SrRNA和cytb基因序列,並對鹿茸的產物進行了測序,結果表明動物類藥材可以用標準的藥材作參照,同時進行擴增,經過電泳達到鑒別的目的。